微量DNA捕捉ナノワイヤと迅速SNP検出装置を用いた脳腫瘍リキッドバイオプシー

使用捕获微量 DNA 的纳米线和快速 SNP 检测设备进行脑肿瘤液体活检

• 批准号: 20K17927
• 负责人: 栗本 路弘
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Aichi Children’s Health and Medical Center (2022)Nagoya University (2020-2021)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K17927/
• 关键词: 脳腫瘍; ゲノム解析; リキッドバイオプシー; IDH; TERT; SNP; IDH1

遺伝子異常に基づく神経膠腫の病型分類に必要な遺伝子変異を術中に極めて短い時間でまとめて診断する技術を継続開発した。既に IDH1 変異に対して技術を確立したが さらに TERT、EGFR、BRAF、PTCH1などのhot spot 変異をもつ遺伝子変異に対してもプローブ開発を行い、多数の原発性脳腫瘍に対応できる術中オールインワン診断システムを構築し臨床応用を開始した。これらの遺伝子変異の解析をすすめるため、利用可能な細胞株を検索し過剰発現細胞株を作成、強制発現プラスミドベクターを作成した。蛍光プローブであるQプローブを用いて、全自動 SNPs 解析装置 i-densyで解析した。上記解析の対象となった同一腫瘍組織の残検体を用いて、同定された異常があることをアンプリコンシークエンスにて変異を同定し比較対象とし、QIAamp DNAMini Kit (QIAGEN)を使用して腫瘍からDNAを採取、対象遺伝子および各染色体のhetero DNAに対して作成した Not Ⅰ配列付きプライマーを用いたPCRを行い対象領域のアンプリコンを作成、アンプリコンを Not Ⅰにてdigestion した後、T4 ligase にてligation を行うことにより長鎖 DNAを作成し、次世代シークエンサー用のアダプター配列をligationしHiseq 2500でシークエンスを行うことで、1%までの低アレル頻度の変異を高い正確性をもって判断することができた。染色体コピー数異常についてはさらに正確性を高めるため MLPA法を用いて再解析を行った。また髄芽腫および頭蓋内胚細胞腫瘍が疑われる患者に対し、上記で確立した技術を用いて摘出検体に対する遺伝子変異の術中迅速診断を試みた。

我们继续开发一项技术来诊断基于遗传异常在很短的时间内基于遗传异常的类型分类所需的基因突变。我们已经建立了用于IDH1突变的技术，但是我们还开发了用于具有热点突变（例如TERT，EGFR，BRAF和PTCH1）的基因突变的探针，并建立了可以处理大量原发性脑肿瘤的术中全合用诊断系统，并开始了临床临床应用。为了推进对这些基因突变的分析，搜索了可用的细胞系以创建过表达的细胞系，并创建强制表达质粒向量。使用全自动SNP分析仪i-Densy使用Q探针，荧光探针进行分析。使用来自同一肿瘤组织的残留样品，使用扩增子测序鉴定突变以比较突变，并使用扩增子测序，并使用Qiaamp dnamini kit（qiagen）从肿瘤中收集DNA，使用i序列的primors for imple sex ompl rym empl ompl ompl ompl ompl heretle dna segormor，qiaamp dnamini kit（qiagen）进行了qiaamp dnamini kit（qiagen）的qiaamp dnamini kit（qiagen），从而收集了DNA。非I中的扩增子，然后与T4连接酶结合以形成长链的DNA，与下一代序列绑扎，并用HISEQ 2500进行测序，可以高精度确定低等位基因频率低至1％的突变。使用MLPA方法将染色体拷贝数异常重新分析以进一步提高准确性。此外，试图使用上面确定的技术来快速诊断切除的标本中的基因突变，并尝试使用疑似髓母细胞瘤和颅内生殖细胞肿瘤的患者。