理論的リバースジェネティクス法で迫る、HCNチャネルの新たな機能的構造の解明

使用理论反向遗传学方法阐明 HCN 通道的新功能结构

基本信息

批准号：
20K16125
负责人：
中島明子
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K16125/
关键词：
cAMP オルソログバイオインフォマティクス HCNチャネル

项目摘要

理論的リバースジェネティクスは、生物進化におけるアミノ酸配列のバリエーションについて変異分布関数（積率母関数数）の2次モーメントを利用する。2次モーメントは数学的には分散に相当する項目で、変異の平均頻度（1次モーメント）では表しきれない「変異のしやすさ」の指標である。この項目を「変異アミノ酸種ｘ生物種の和」として離散的な代数和で表現することで、計算の簡略化を試みた。実際に、cAMP関連タンパク質であるHCNチャネルに適用したところ、HCNチャネルのcAMP結合ドメイン、電位依存性ドメイン、さらにPIP2結合部位など複数にわたる既知の機能ドメインを明確にラベルすることに成功した。さらに、このBioinformatics計算法（Phylogenetic kinetic value法：PKV法）を、cAMP関連タンパク質OMPに適用したところ、OMPの内部にカルパインファミリーの切断サイトを見つけた。OMPはCAPN5では切断されなかったが、CAPN5以外のCAPNによって切断される可能性を見出した（Mol. Brain, 2022）。またOMPには、高度に保存されたロイシンリッチ領域があることも突き止めた。ロイシンリッチ領域は他のタンパク質において核外輸送シグナル（NES)として知られている。ロイシン部分をアラニンへ変異させたアラニン変異型OMPを作成し、HEK293T細胞に発現させた。すると、アラニン変異型OMPは野生型OMPに比べて核に存在する割合が増加し、ロイシンリッチ領域がNESとして機能することを突き止めた（Mol. Brain, 2022）。

理论反向遗传学使用突变分布函数的二阶矩（矩生成函数数）来表示生物进化过程中氨基酸序列的变化。从数学上讲，二阶矩是与方差相对应的一项，是无法用突变平均频率（一阶矩）来表达的“突变难易程度”的指标。我们试图通过将此项表示为离散代数和来简化计算，即“突变氨基酸种类 x 生物种类之和”。事实上，当应用于cAMP相关蛋白HCN通道时，我们成功地清楚地标记了HCN通道的多个已知功能域，包括cAMP结合域、电压依赖性域和PIP2结合位点。此外，当将该生物信息学计算方法(系统发育动力学值法：PKV法)应用于cAMP相关蛋白质OMP时，在OMP内部发现了钙蛋白酶家族切割位点。尽管 OMP 不被 CAPN5 裂解，但我们发现它可能被 CAPN5 以外的 CAPN 裂解 (Mol. Brain, 2022)。他们还发现 OMP 含有高度保守的富含亮氨酸区域。富含亮氨酸的区域在其他蛋白质中被称为核输出信号 (NES)。我们创建了一种丙氨酸突变的 OMP，其中亮氨酸部分突变为丙氨酸，并在 HEK293T 细胞中表达它。他们发现，与野生型 OMP 相比，细胞核中存在的丙氨酸突变型 OMP 的比例有所增加，并且富含亮氨酸的区域起到 NES 的作用 (Mol. Brain, 2022)。