理論的リバースジェネティクス法で迫る、HCNチャネルの新たな機能的構造の解明

使用理论反向遗传学方法阐明 HCN 通道的新功能结构

基本信息

批准号：
20K16125
负责人：
中島明子
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K16125/
关键词：
cAMP オルソログバイオインフォマティクス HCNチャネル

项目摘要

理論的リバースジェネティクスは、生物進化におけるアミノ酸配列のバリエーションについて変異分布関数（積率母関数数）の2次モーメントを利用する。2次モーメントは数学的には分散に相当する項目で、変異の平均頻度（1次モーメント）では表しきれない「変異のしやすさ」の指標である。この項目を「変異アミノ酸種ｘ生物種の和」として離散的な代数和で表現することで、計算の簡略化を試みた。実際に、cAMP関連タンパク質であるHCNチャネルに適用したところ、HCNチャネルのcAMP結合ドメイン、電位依存性ドメイン、さらにPIP2結合部位など複数にわたる既知の機能ドメインを明確にラベルすることに成功した。さらに、このBioinformatics計算法（Phylogenetic kinetic value法：PKV法）を、cAMP関連タンパク質OMPに適用したところ、OMPの内部にカルパインファミリーの切断サイトを見つけた。OMPはCAPN5では切断されなかったが、CAPN5以外のCAPNによって切断される可能性を見出した（Mol. Brain, 2022）。またOMPには、高度に保存されたロイシンリッチ領域があることも突き止めた。ロイシンリッチ領域は他のタンパク質において核外輸送シグナル（NES)として知られている。ロイシン部分をアラニンへ変異させたアラニン変異型OMPを作成し、HEK293T細胞に発現させた。すると、アラニン変異型OMPは野生型OMPに比べて核に存在する割合が増加し、ロイシンリッチ領域がNESとして機能することを突き止めた（Mol. Brain, 2022）。

理论反向遗传学利用了生物进化中氨基酸序列的变化的突变分布函数的二阶力矩（乘积模式产生功能的数量）。次要力矩在数学上等同于方差，并且是“突变易于”的指标，而突变的平均频率（一阶矩）无法完全表达。我们试图通过将此项目表示为“突变氨基酸物种的总和x活生物体的种类”来简化计算。实际上，当应用于与CAMP相关的蛋白质HCN通道时，它成功地清楚地标记了多个已知的功能域，例如HCN通道的camp结合域，依赖电压依赖性域和PIP2结合位点。此外，当将这种生物信息学计算方法（PKV方法）应用于与CAMP相关的蛋白质OMP时，在OMP内发现了Calpain家族的裂解位点。尽管OMP与CAPN5没有断开连接，但发现除了CAPN5以外的CAPN可以将其断开（Mol。Brain，2022）。我们还发现，OMP具有高度保守的浅亮氨酸区域。富含亮氨酸的区域在其他蛋白质中被称为核出口信号（NES）。产生了丙氨酸突变体，其中亮氨酸部分突变为丙氨酸，并在HEK293T细胞中表达。这表明与野生型OMP相比，丙氨酸突变体OMP的核中存在的核比例增加，并且富含亮氨酸的区域的作用为NES（Mol。Brain，2022）。