アデノ随伴ウイルスを用いた痛みの遺伝子治療の基礎的基盤の構築

为利用腺相关病毒进行疼痛基因治疗奠定基础

基本信息

批准号：
21K08940
负责人：
川田大輔
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08940/
关键词：
GAD67 GABA 遺伝子治療ウイルスベクター痛みアデノ随伴ウイルス

项目摘要

近年の医学の発展により遺伝子治療は多くの領域で注目されており、中でもウイルスベクターを用いた遺伝子治療は、がん治療、代謝疾患、神経疾患等の分野で臨床応用が既に開始している。しかしながら痛みに対する遺伝子治療は未だに確立されていない。我々は今までに痛みの遺伝子治療の有用性や神経障害性疼痛の機序を解明する研究成果を報告してきた。本研究はグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)67を発現させ脊髄後角のγ-アミノ酪酸 (GABA) 合成を促進するウイルスベクターを用いた遺伝子治療の有用性を明らかにし、その鎮痛機序を解明することを目的としている。本研究ではまずはじめにGABA産生の促進のためGAD67を導入するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを作成した。AAVベクターには神経細胞特異的に標的遺伝子を発現させるためのプロモーターを装備させ、神経組織でのみGABA産生が促進する機能を付加している。次に作成したAAVベクターの機能評価を行った。機能評価には初代培養神経細胞および実験動物（ラット）を用いた。緑色蛍光タンパク質（GFP）をサイトメガロウイルス（CMV）またはシナプシンⅠ（SYN）プロモーター制御下で発現するAAVベクター（CMV-AAVベクターおよびSYN-AAVベクター）を作成した。この2種のAAVベクターをラットに髄注しPCR法及び免疫染色法を用いて脊髄における導入遺伝子の発現を調べた。PCR法において、CMV-AAVベクター投与群およびSYN-AAVベクター投与群の両群で、ラット脊髄でのGFP発現が誘導された。免疫染色法では、SYN-AAVベクター投与群でのみ神経細胞に特異的なGFP発現が認められた。本研究により、SYNプロモーターを持つAAVベクターは、ラット脊髄の神経細胞へ特異的に標的遺伝子を導入する性質を持つことが明らかになった。

近年来，随着医学的发展，基因治疗在许多领域引起了人们的关注，利用病毒载体进行基因治疗的临床应用已经开始在癌症治疗、代谢疾病、神经系统疾病等领域的临床应用。然而，针对疼痛的基因疗法尚未建立。迄今为止，我们已经报道了阐明基因疗法对疼痛的有用性以及神经性疼痛机制的研究结果。本研究旨在阐明使用表达谷氨酸脱羧酶（GAD）67并促进脊髓背角γ-氨基丁酸（GABA）合成的病毒载体进行基因治疗的有用性，并阐明其镇痛机制。是在本研究中，我们首先创建了一种腺相关病毒（AAV）载体，该载体引入GAD67以促进GABA的产生。 AAV载体配备有在神经细胞中特异性表达靶基因的启动子，并且具有仅在神经组织中促进GABA产生的附加功能。接下来，我们对创建的 AAV 载体进行了功能评估。原代培养的神经元和实验动物（大鼠）用于功能评估。我们创建了在巨细胞病毒 (CMV) 或突触蛋白 I (SYN) 启动子控制下表达绿色荧光蛋白 (GFP) 的 AAV 载体（CMV-AAV 载体和 SYN-AAV 载体）。将这两种类型的AAV载体鞘内注射到大鼠体内，并使用PCR和免疫染色方法研究导入基因在脊髓中的表达。在PCR法中，CMV-AAV载体施用组和SYN-AAV载体施用组的大鼠脊髓中都诱导了GFP表达。免疫染色显示仅在 SYN-AAV 载体施用组中存在神经元特异性 GFP 表达。这项研究表明，带有 SYN 启动子的 AAV 载体能够将目标基因特异性引入大鼠脊髓神经元中。