新規病原体核酸検査に用いる汎用的精度管理標品の迅速な作成を検証に資する研究

有助于验证快速创建用于新型病原体核酸检测的通用质量控制标本的研究

基本信息

批准号：
21K08497
负责人：
石井良和
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Toho University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

PCR検査に代表される病原体核酸検査において、その精度管理は重要な課題である。精度管理すべき検査工程として、核酸抽出から試薬混合調製までの検査前プロセス、DNA増幅(標的がRNAの場合は逆転写工程を含む) から検出までの検査プロセス、結果解釈から報告までの検査後プロセスがある。検査前プロセスから検査後プロセスまでの全工程を精度管理するには、標的核酸が対象病原体と同等の膜などに封入された状態のフルプロセスコントロール試料が必要である。本研究では、SARS-CoV-2のPCR検査をモデルとして、任意のRNA塩基配列を組み込んでパーティクルに封入できる市販の組換えレンチウイルス作成キット (タカラバイオ) を用いたフルプロセスコントロール試料作製方法を検証する。この方法は、新たに流行する病原体の病原体核酸検査の迅速なフルプロセスコントロール試料作製への応用が期待される。フルプロセスコントロールに組み込む標的は、国立感染症研究所および米国Center for Disease Control and Preventionが公表するreverse-transcription (RT)-PCRの標的に加え、本邦で利用可能なRT-qPCR検査キットの標的とされている、Orf1b, S, およびE遺伝子の一部を直列につなぎ合わせた配列を、人工遺伝子合成サービスに委託して入手した。これをレンチウイルスベクタープラスミド pLVSINに挿入し、Lentiviral High Titer Packaging MixとともにLenti-X 293T細胞にコトランスフェクションすることにより、任意の配列をRNAゲノムに有する組換えレンチウイルスを取得した。今後、組換えレンチウイルスの安定性を確認した後、外部精度管理における精度管理試料としての妥当性を確認する。

准确性控制是病原体核酸检测（例如PCR检测）中的一个重要问题。需要质量控制的检测过程包括从核酸提取到试剂混合制备的检测前过程、从DNA扩增（如果目标是RNA则包括逆转录）到检测的检测过程以及从结果判读的检测后过程去举报有一个过程。为了控制从检测前到检测后过程的所有步骤的准确性，需要将目标核酸封装在相当于目标病原体的膜等中的全过程控制样品。在本研究中，我们以SARS-CoV-2的PCR检测为模型，利用市售的重组慢病毒生产试剂盒（Takara Bio）开发了一种全过程控制样品制备方法，该试剂盒可以掺入任意RNA碱基序列并将其封装成粒子验证。该方法有望应用于新流行病原体核酸检测的快速全流程控制样品制备。纳入全过程控制的目标包括国立传染病研究所和疾病预防控制中心公布的逆转录（RT）-PCR目标，以及日本现有的RT-qPCR检测试剂盒的目标。我们委托人工基因合成服务获得了 Orf1b、S 和 E 基因的部分串联连接的序列。将其插入慢病毒载体质粒pLVSIN中，与慢病毒高滴度包装混合物共转染Lenti-X 293T细胞，获得RNA基因组中具有任意序列的重组慢病毒。未来，在确认重组慢病毒的稳定性后，我们将在外部质控中确认其作为质控样本的有效性。