CCN２の転写因子様機能を介した線維症のキープレイヤー筋線維芽細胞分化機構の解明

阐明由 CCN2 转录因子样功能介导的肌成纤维细胞分化机制，这是纤维化的关键参与者

基本信息

批准号：
20K09889
负责人：
西田崇
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

線維症の増悪に関わる筋線維芽細胞は線維芽細胞から分化すると考えられているが、その分化メカニズムは未だ不明である。本研究課題の目的は、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化にCellular communication network factor 2 (CCN2)がどの様に関わっているを明らかにすることであり、これまで、核内に移行したCCN2が転写共役因子としてCCN2自体及び筋線維芽細胞分化のmaster regulatorであるPU.1の発現制御に関与する可能性を示した。今回、これらの知見の論文化に向けて、さらに詳細に以下のことを検討した。1.シグナルペプチドを欠失させたCcn2のN末にFlag-Tagを付加したFlag-Ccn2あるいは完全長のCcn2のC末にHA-Tagを付加したCcn2-HAのそれぞれの発現プラスミドをNIH3T3細胞に遺伝子導入した後、細胞質画分と核画分に厳密に分離し、各Tag抗体でWestern blot解析を行った結果、Ccn2-HAを導入した細胞でのみ核画分にシグナルを認めた。2.Ccn2-HAを遺伝子導入したNIH3T3細胞の核画分に抗YAP抗体を加え免疫沈降を行った後、抗HA抗体でWestern blot解析を行うと、HAのバンドが検出され、YAPとCCN2の結合が示唆された。3.Ccn2-HAを遺伝子導入したNIH3T3細胞のゲノムDNAを抽出後、抗CCN2抗体で免疫沈降し、CCN2及びPU.1のプロモーター領域のプライマーを用いてPCRを行った結果、CCN2及びPU.1のプライマーによってDNA断片の増幅が検出された。4.Ccn2-HAを遺伝子導入したNIH3T3細胞の核画分とCcn2プロモーター領域部で作成したDNAプローブによるゲルシフトアッセイによって、核画分タンパク質とDNAプローブとの結合が示された。

涉及加剧纤维化的肌纤维细胞被认为与成纤维细胞有区别，但分化机制仍然未知。 The purpose of this research topic was to clarify how Cellular communication network factor 2 (CCN2) is involved in differentiation from fibroblasts to myofibroblasts, and so far, we have shown that CCN2, which has translocated into the nucleus, may be involved in the expression control of CCN2 itself as transcriptional cogators and PU.1, the master regulator of myofibroblast differentiation.在本文中，我们更详细地研究了以下内容，以解决这些发现的文化。 1. Expression plasmids of Flag-Ccn2 with Flag-Tag added to the N-terminus of Ccn2 with signal peptide deleted, or Ccn2-HA with HA-Tag added to the C-terminus of full-length Ccn2, were transfected into NIH3T3 cells, and then the cells were closely separated into the cytoplasmic fraction and nuclear fraction, and Western blot analysis was performed with each Tag antibody,仅在引入CCN2-HA的细胞中观察到核分数中的信号。 2。将抗-yAP抗体添加到用CCN2-HA转染的NIH3T3细胞的核分数中，进行免疫沉淀，然后使用抗HA抗体进行蛋白质印迹分析，并检测到HA带，表明YAP和CCN2的结合。 3。在用CCN2-HA转染的NIH3T3细胞的基因组DNA后，用抗CCN2抗体对细胞进行免疫沉淀，并使用CCN2和PU.1的启动子区域中的引物进行PCR，并检测到DNA片段的启动子区域，并被CCCN2和PU.1和PU.1的Primers检测。 4。使用在CCN2-HA转染的NIH3T3细胞和CCN2启动子区域的核比例中产生的DNA探针的凝胶移位测定显示核分数蛋白与DNA探针的结合。