標的ゲノム編集/系統的ノックダウンによる染色体転座頻度を増加させる因子の探索

通过靶向基因组编辑/系统性敲低寻找增加染色体易位频率的因素

基本信息

批准号：
21K07681
负责人：
津山尚宏
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Fukushima Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07681/
关键词：
染色体転座電離放射線 CRISPR-Cas9 放射線感受性責任遺伝子 CRISPR/Cas9

项目摘要

電離放射線はDNA二本鎖切断を介して細胞ゲノムに転座などのランダムな染色体異常を誘発し、異常頻度は線量依存的に増加する。DNA二本鎖切断修復の過程で、異なる切断末端同士が再結合して染色体異常（転座）が生じる分子機構の全体像は不明である。また特定の染色体転座は疾病の原因となるため、染色体転座を調節する機構の解明は重要である。本研究ではまず、正常ヒト集団の自然に生じる染色体転座頻度と放射線によって誘導される染色体転座頻度の基礎データを得るため、インフォームドコンセントを得た若い健常人の末梢血リンパ球を単離し、自然に生じた染色体転座頻度および放射線照射により誘発された転座頻度を解析している。同時に培養細胞を用いて染色体転座の分子機構解析を行っている。CRISPR-Cas9を用いたt(11;14)転座誘導系に加えt(11;22), t(5;6)転座誘導系を作成し、導入した培養細胞の転座頻度をリアルタイムPCRでモニターする。導入する細胞には、予め、DNA二本鎖切断(DSB)修復シグナル・ゲノム不安定性、放射線感受性を修飾する責任遺伝子、代謝やレドックス制御シグナル分子群について、特異的阻害剤処理やレトロウイルスshRNA発現ベクターによる系統的なノックダウンを行い、転座頻度の変化を観察する。さらにゲノム編集を用いて作製したATMなどの既知遺伝子異常のヘテロ接合細胞を用いた転座誘導影響解析を行う。加えて、未知の機序解明のため全ゲノムCRISPR-Cas9ノックアウトライブラリー導入による易転座誘発性の獲得と標的同定を行い、染色体転座誘発機序の理解を目指す。

电离辐射会诱发随机染色体异常，例如通过 DNA 双链断裂导致细胞基因组易位，并且异常频率以剂量依赖性方式增加。 DNA双链断裂修复过程中不同切口重组时发生染色体异常（易位）的分子机制的总体情况尚不清楚。此外，由于特定的染色体易位会导致疾病，因此阐明调节染色体易位的机制非常重要。在本研究中，我们首先在知情同意的情况下分离出年轻健康个体的外周血淋巴细胞，以获得正常人群中自然发生的染色体易位频率和辐射引起的染色体易位频率的基本数据，并对其频率进行分析。自然发生的染色体易位和辐射引起的易位频率。同时，我们正在利用培养细胞分析染色体易位的分子机制。除了使用CRISPR-Cas9的t(11;14)易位诱导系统外，我们还创建了t(11;22)和t(5;6)易位诱导系统，并使用实时PCR测量了培养细胞中的易位频率监控。待引入的细胞用特定抑制剂和逆转录病毒 shRNA 表达进行处理，以表达 DNA 双链断裂 (DSB) 修复信号、负责改变基因组不稳定性和放射敏感性的基因以及代谢和氧化还原控制信号分子，并使用载体进行系统敲低。观察易位频率的变化。此外，我们将使用基因组编辑创建的已知遗传异常（例如 ATM）杂合细胞来分析易位诱导的影响。此外，为了阐明未知的机制，我们将引入全基因组CRISPR-Cas9敲除文库，以获得易于易位诱导的特性并识别靶标，旨在了解染色体易位诱导的机制。