腸管上皮組織におけるミクロオートファジーの生理機能及び分子機序

肠上皮组织微自噬的生理功能及分子机制

基本信息

批准号：
21K06553
负责人：
和田戈虹
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Doshisha Women's College of Liberal Arts
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

初期胚組織VEでのミクロオートファジーには低分子量GTPase Rab7 の機能が必須であった（Kawamura et al. Nat Commun 2012）。そこで、小腸上皮系細胞でのミクロオートファジーにおけるRab7、ならびにRab7のeffector分子であるmVam2の必要性を検討する。申請者はCre recombinase依存の組換えによってmVam2、rab7遺伝子が破壊できる条件的遺伝子破壊アリル(mVam2flox、rab7flox)を作出している。小腸上皮細胞特異的にCre recombinaseを発現するVillin-Creマウスを交配することで、小腸上皮細胞特異的Rab7、mVam2コンディショナル・ノックアウト(cKO)マウスを作製することが可能である。今年度、これらのコンディショナル・ノックアウト(cKO)マウスが樹立され、さらに、Rab7、mVam2両遺伝子のダブル欠損マウスの作製に成功している。現在これらの欠損マウスを用いて、小腸上皮細胞の形態、空腸、回腸での蛍光デキストランの取り込み、エンドソーム・リソソーム間の小胞輸送のマーカータンパク質の局在などについて、野生型と比較に表現型を詳細に解析を進めている。また、野生型とcKOの新生児の体重増加を測定すると同時に、血清中成分の量を測定し、腸管を介した栄養吸収の効率を比較する。さらに、in vitroの実験系を用いて液胞型ATPase阻害剤、タンパク質分解酵素阻害剤、脂質分解阻害剤、イノシトールリン脂質の変換阻害剤等を用いて、小腸上皮細胞の取り込みのメカニズムを解析中である。

低分子量 GTPase Rab7 的功能对于早期胚胎组织 VE 中的微自噬至关重要（Kawamura 等人，Nat Commun 2012）。因此，我们将研究Rab7和Rab7的效应分子mVam2在小肠上皮细胞微自噬中的必要性。申请人创建了条件基因破坏等位基因（mVam2flox、rab7flox），其可以通过Cre重组酶依赖性重组来破坏mVam2和rab7基因。通过在小肠上皮细胞中特异性表达 Cre 重组酶的 Villin-Cre 小鼠杂交，可以产生小肠上皮细胞特异性 Rab7 和 mVam2 条件敲除 (cKO) 小鼠。今年，我们建立了这些条件敲除（cKO）小鼠，并且我们还成功创建了 Rab7 和 mVam2 基因双缺陷小鼠。目前，我们正在使用这些缺陷小鼠来比较野生型的表型，包括小肠上皮细胞的形态、空肠和回肠中荧光右旋糖酐的摄取以及内体和回肠之间囊泡运输的标记蛋白的定位。溶酶体的详细分析正在进行中。此外，我们还将测量野生型和cKO新生儿的体重增加，测量血清成分的量，并比较通过肠道吸收营养的效率。此外，我们目前正在使用液泡ATP酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、脂质降解抑制剂、肌醇磷脂转化抑制剂等体外实验系统来分析小肠上皮细胞摄取的机制。