孤発性IRF2BPL変異の患者由来iPS細胞を用いたNEDAMSS病態モデル確立

利用IRF2BPL散发突变患者的iPS细胞建立NEDAMSS病理模型

基本信息

批准号：
20K07763
负责人：
井上健一
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Dokkyo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

正常型IRF2BPLおよび変異型IRF2BPL安定発現細胞株を用いて、タンパク質複合体の精製を試みた。正常型IRF2BPLのアフィニティタグにおける精製効率は高くなかったが、共沈降したタンパク質複合体の中に既知の結合タンパク質が含まれていた。IRF2BPドメインを共有するファミリータンパク質、IRF2BP2の結合を確認した。同様に変異型IRF2BPLをアフィニティタグで精製したところ、大量の内因性IRF2BPLが共沈降していた。アフィニティ樹脂に結合しない内因性IRF2BPLも大量に存在したことから、変異型IRF2BPLは内因性IRF2BPLの遺伝子発現を誘導することが示唆された。マイクロアレイの遺伝子発現解析では、NEDAMSS患者iPS細胞におけるIRF2BPL遺伝子発現が家族iPS細胞と比べて有意に上昇していた。以上の結果から、変異型IRF2BPLはそれ自体が内因性IRF2BPLタンパク質を発現誘導し、互いに結合することが明らかとなった。また正常型IRF2BPLタンパク質はファミリーであるIRF2BP2と結合していることから、このタンパク質はIRF2BPドメインを介して、ファミリータンパク質同士で協働することが示唆された。先行研究では、変異型IRF2BPLの細胞内局在は専ら強制発現系を用いて調べられている(Sinha Ray et al., Cell Rep., 2022)。ところが強制発現によって内因性IRF2BPLが大量に誘導されるのであれば、それらの観察が病態を正確に反映しているのか疑問が生じる。研究期間を延長した最終年度では、患者iPS細胞で内因性の変異型IRF2BPLが細胞内のどこに局在しているのか、ファミリータンパク質であるIRF2BP1とIRF2BP2も含めた内因性のIRF2BPファミリーの局在および機能的影響について調べる。

我们试图使用正常的IRF2BPL和突变体IRF2BPL稳定表达细胞库存来完善蛋白质复合物。正常类型IRF2BPL的纯化效率不高，但在沉积物染色蛋白复合物中包含已知的结合蛋白。确认了具有IRF2BP结构域的家族蛋白IRF2BP2的组合。同样，当使用亲和力标签纯化突变的IRF2BPL时，大量内源性IRF2BPL是沉积的。不与亲和力树脂结合的大量内源性IRF2BPL表明突变体IRF2BPL诱导内源性IRF2BPL基因表达。在微射线基因表达分析中，与家族IPS细胞相比，NEDAMSS患者IPS细胞的IRF2BPL基因表达显着增加。上述结果表明，突变的IRF2BPL本身诱导并诱导的内源性IRF2BPL蛋白并相互结合。正常类型的IRF2BPL蛋白与家族IRF2BP2结合，表明该蛋白将通过IRF2BP结构域在家族蛋白之间进行协作。在先前的研究中，仅使用强制表达（Sinha Ray等，Cell Rep。，2022）专门检查突变体IRF2BPL的细胞内位置。但是，如果强制表达诱导大量内源性IRF2BPL，那么这些观察结果是否准确反映了病理是值得怀疑的。在过去的一年中，研究期限延长，患者的IPS细胞位于IRF2BPL的细胞中，以及包括IRF2BP1和IRF2BP2的国际IRF2BP家族，这是家族蛋白。