ゴルジ体微小管の構築制御に基づく癌細胞の集団的浸潤機構の解明

基于高尔基体微管组装调控阐明癌细胞集体侵袭机制

• 批准号: 20K07575
• 负责人: 西田 満
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Fukushima Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K07575/
• 关键词: ゴルジ体微小管; アセチル化チューブリン; 安定化微小管; ゴルジ体由来微小管; 大腸癌; 集団浸潤; がん細胞浸潤; 細胞極性; 細胞骨格; ゴルジ体微小管; アセチル化チューブリン; 安定化微小管; ゴルジ体由来微小管; 大腸癌; 集団浸潤; がん細胞浸潤; 細胞極性; 細胞骨格

これまでに、IFT20がゴルジ体の浸潤側への再配置を制御していることやリーダー細胞における安定化微小管の形成に関与していることを見出した。これらの知見を踏まえ、本年度はIFT20がゴルジ体由来微小管の安定化・極性化を制御する機構を理解するため、ゴルジ体由来微小管の動態をライブセルイメージングによって解析した。まず、複数の大腸癌細胞株に微小管プラス端マーカーであるEB1-GFPの発現プラスミドを導入し、安定発現株を複数樹立した。これら　の各細胞株について、ライブセルイメージング解析によりEB1-GFPの移動速度を計測した。その結果どの細胞株も同じスピードでEB1-GFPが移動することが確認されたため、以降はDLD1細胞の１クローンを主に用いて解析した。IFT20が浸潤細胞の微小管動態にどのような役割を担っているのか検討するため、EB1-GFP発現DLD1細胞の2D invasion assayにおいて、リーダー細胞でのライブイメージング解析を行った。EB1-GFPのトラッキング解析のため、MatLabおよびアドインソフト のU-Trackを用いた。各トラックの浸潤方向に対する角度（浸潤方向に伸長するものが0°、中心側へ伸長するものが180°となる）を計測した結果、コントロール細胞に比べIFT20ノックダウン細胞では浸潤方向（0°方向）に伸長する微小管の数が有意に低下した。さらに、IFT20をノックダウンしたリーダー細胞において、微小管伸長が一時的に停止する頻度が増加した。一方、微小管の伸長速度自体はIFT20ノックダウンによる変化は認められなかった。以上の結果から、DLD1細胞の集団的浸潤において、IFT20はリーダー細胞における極性化した微小管伸長を制御していることが示唆された。

到目前为止，已经发现IFT20调节高尔基体的迁移到侵入性侧，并参与了领导细胞中稳定的微管的形成。基于这些发现，今年，我们通过活细胞成像分析了高尔基衍生的微管的动力学，以了解IFT20控制高尔基衍生微管的稳定和极化的机制。首先，引入了多个结肠癌细胞系，并带有EB1-GFP的表达质粒，微管加端标记，并建立了多个稳定的表达菌株。对于这些细胞系中的每一种，通过实时细胞成像分析来测量EB1-GFP的运动速度。结果，已经证实EB1-GFP以相同的速度在所有细胞系中迁移，然后使用DLD1细胞的一个克隆进行了随后的分析。为了研究IFT20在浸润细胞的微管动力学中的作用，在对表达EB1-GFP的DLD1细胞的2D入侵测定中，在领导者细胞中进行了实时成像分析。 MATLAB和加载软件U型轨道用于跟踪EB1-GFP的分析。与对照细胞相比，在IFT20敲低细胞中，测量了每个轨道相对于入侵方向的角度（在入侵方向为0°，中央延伸为180°），并在IFT20敲除细胞中显着降低了在入侵方向（0°方向）的微管数。此外，微管延伸的频率暂时停止在引导细胞中击落IFT20。另一方面，由于IFT20敲低，微管延伸速度本身没有变化。这些结果表明，IFT20调节DLD1细胞集体侵袭的领导细胞中极化微管延伸。