低酸素シグナルを感知する下垂体前葉細胞の同定と内分泌機能の制御機序の解明

识别感知缺氧信号的垂体前叶细胞并阐明内分泌功能的控制机制

基本信息

批准号：
20K07249
负责人：
藤原研
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kanagawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は①低酸素応答細胞の組織学的解析、②低酸素シグナルを介する細胞間相互作用、③低酸素シグナルによる細胞機能調節、について解析する。2021年度にラット下垂体腫瘍から樹立された成長ホルモンとプロラクチンを産生する細胞株であるMtT/SM細胞を下垂体前葉細胞のモデルとして、低酸素培養条件の確立と発現遺伝子解析を行った。本年度は、その条件を用いて、ラット下垂体前葉の初代培養細胞系で正常細胞での低酸素応答遺伝子の同定を行った。まず、成獣雄ラットの下垂体前葉を摘出し、トリプシン、コラゲナーゼ、EDTA処理により単離細胞を得た。細胞を35 mmシャーレに播種し、通常酸素濃度で48時間の培養を行い、その後通常酸素濃度または10%酸素濃度それぞれで24時間の培養を行った。細胞からRNeasy Mini kitを用いてRNAを抽出した。このRNAを鋳型として逆転写反応によりcDNAを合成し、PCRを行ったところ、通常酸素濃度および10%酸素濃度で培養したいずれでもHIF-1αが発現していることが確かめられた。続いて、上記の酸素濃度条件下で下垂体前葉単離細胞を培養したのち、それぞれの酸素濃度で発現する遺伝子をRNA-seq解析で比較した。RNA-seq解析は日本ジーンウィズ社に委託した。その結果、10%酸素濃度で培養することで通常酸素濃度培養よりも2倍以上有意に増加するもしくは減少する遺伝子を同定することに成功した。今後、これら遺伝子が下垂体前葉のどのような細胞種で発現し、低酸素条件下で下垂体細胞の機能にどのような役割があるかを調べる必要がある。

这项研究将分析1）缺氧反应性细胞的组织学分析，2）通过缺氧信号进行细胞 - 细胞相互作用，以及3）通过缺氧信号调节细胞功能调节。 MTT/SM细胞是一种产生生长激素和催乳素的细胞系，在2021年由大鼠垂体肿瘤建立，用作前垂体前细胞的模型，以建立低氧培养条件并分析表达基因。今年，使用这些疾病，在大鼠前垂体的原发性培养细胞系中，在正常细胞中鉴定了缺氧反应性基因。首先，去除成年雄性大鼠的前垂体，并通过胰蛋白酶，胶原酶和EDTA处理获得分离的细胞。将细胞播种在35 mM培养皿中，并在正常的氧气浓度下培养48小时，然后在正常氧气浓度下培养，或10％的氧气浓度24小时。使用RNeasy Mini试剂盒从细胞中提取RNA。将此RNA作为模板，通过逆转录反应合成cDNA，并进行了PCR，并证实HIF-1α在正常氧浓度和10％氧浓度中均表达。随后，通过RNA-Seq分析比较在上述氧气浓度条件下培养前垂体分离的细胞后，在每个氧浓度下表达的基因。 RNA-seq分析委托给日本Genewith。结果，当以10％的氧浓度培养时，我们成功地鉴定出其比正常氧浓度培养物显着增加或降低2倍的基因。将来，有必要研究这些基因在垂体前腺体中表达的细胞类型，以及它们在低氧条件下它们在垂体的功能中具有什么作用。