Development of a method to induce maturation of fetal hematopoietic stem cells

诱导胎儿造血干细胞成熟的方法的开发

• 批准号: 21K08431
• 负责人: 小林 央
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: National Center for Global Health and Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08431/
• 关键词: 造血幹細胞; 胎生期; 成熟; 遺伝子編集; CRISPR/Cas9; 静止期維持培養

１．造血幹細胞の成熟化マーカーの探索自身、および公共データベースのRNA-seqデータの解析およびqPCRの解析からMuc13,Spns3, Cpne2, Ndrg1が成熟に伴い上昇することを確認し、かつ上昇のタイミングがそれぞれ異なることを見出した。Muc13, Spns3が出生後4週間以内の早期に上昇するのに対し、Ndrg1は8週齢程度になるとはじめて加齢することがわかり、造血幹細胞の成熟過程は単相性ではなく複相的に進行することを示唆した。２．胎生期造血幹細胞の成熟化誘導因子の探索と成熟メカニズムの解明各種の培養条件や転写因子の過剰発現を通じて成熟化誘導因子を探索した結果、間葉系細胞株との共培養系において、骨髄環境を模倣する形で胎児造血幹細胞を成熟させかつ長期間維持可能となった。この間にMuc13, Spns3、Cpne2は生体内同様、時間経過とともに徐々に発現が亢進する一方で、特定の因子によって発現が変動するわけではなく外在性の因子ではなく造血幹細胞自身の有する内在性のプログラムが成熟過程に関わっていることが示唆された。一方、Ndrg1は生体内と異なり100日を超える長期の培養後も発現が亢進せず、共培養系から、脂質リッチな成体造血幹細胞用の培養環境に移すことで発現するようになることから、微小環境によって発現が制御されることが示唆された。３． 遺伝子機能解析のための遺伝子編集技術の開発マウスの造血幹細胞についてCRISPR/Cas9システムを用いて様々な条件を検討し、ノックアウト効率の最適化を試みた。具体的には高サイトカイン条件で16-24時間のprecultureを経た後、sgRNA+Cas9 complexを導入し、ただちに上記の造血幹細胞静止期維持培養を開始することで、10日間にわたり生着可能な造血幹細胞を維持した(Cell Rep Methods, 2022)

1.通过我们对造血干细胞成熟标志物的搜索，以及对公共数据库的RNA-seq数据分析和qPCR分析，我们证实Muc13、Spns3、Cpne2和Ndrg1随着成熟而增加，并且每次增加的时间不同我发现了。 Muc13 和 Spns3 在出生后 4 周内开始增加，而 Ndrg1 直到 8 周左右才显示出衰老迹象，这表明造血干细胞的成熟过程以多相方式进行，而不是单相方式。 2.寻找胚胎造血干细胞的成熟诱导因子并阐明成熟机制通过各种培养条件和转录因子的过度表达来寻找成熟诱导因子，我们发现在与间充质细胞系共培养时，骨骨髓环境 胎儿造血干细胞现在可以以模仿的方式成熟并长期维持在此期间，Muc13、Spns3和Cpne2的表达随着时间的推移逐渐增加，就像在体内一样，但表达不会因特定因素而改变，并且是由于内源性造血干细胞本身而不是外在因素。表明该程序正在进入成熟过程。另一方面，与体内不同，Ndrg1的表达即使在超过100天的长期培养后也不会增加，并且当从成体造血干细胞的共培养系统转移至富含脂质的培养环境时，Ndrg1的表达开始表达有人认为表达受到微环境的调节。 3. 开发用于基因功能分析的基因编辑技术 我们使用 CRISPR/Cas9 系统研究了小鼠造血干细胞的各种条件，并尝试优化敲除效率。具体而言，在高细胞因子条件下预培养16-24小时后，导入sgRNA+Cas9复合物，立即开始上述造血干细胞稳定期维持培养，以产生可存活10天的造血干细胞。细胞代表方法，2022）

项目成果

Context-dependent modification of PFKFB3 in hematopoietic stem cells promotes anaerobic glycolysis and ensures stress hematopoiesis

• DOI: 10.1101/2023.03.16.532898
• 发表时间: 2023-11
• 期刊: eLife
• 影响因子: 7.7
• 作者: Shintaro Watanuki;Hiroshi Kobayashi;Yuki Sugiura;M. Yamamoto;Daiki Karigane;K. Shiroshita;Yuriko Sorimachi;Shinya Fujita;T. Morikawa;S. Koide;M. Oshima;Akira Nishiyama;Koichi Murakami;Miho Haraguchi;Shinpei Tamaki;Takehiro Yamamoto;Tomohiro Yabushita;Yosuke Tanaka;Go Nagamatsu;Hiroaki Honda;Shinichiro Okamoto;N. Goda;Tomohiko Tamura;A. Nakamura-Ishizu;M. Suematsu;Atsushi Iwama;Toshio Suda;K. Takubo

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

维持静止人类造血干细胞的培养方法

• DOI: 10.3791/61938
• 发表时间: 2021
• 期刊: J Vis Exp
• 作者: Mochizuki-Kashio Makiko;Shiozaki Hiroko;Suda Toshio;Nakamura-Ishizu Ayako;Kobayashi H,?Takubo K.
• 通讯作者: Kobayashi H,?Takubo K.