Development of CAR-T cells to treat recurring leukemia post-HCT by targeting mismatched HLA-DP

开发 CAR-T 细胞，通过靶向不匹配的 HLA-DP 来治疗 HCT 后复发性白血病

基本信息

批准号：
21K08369
负责人：
赤塚美樹
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は同種造血細胞移植例の第一死因となっている移植後再発白血病の予防・治療法の開発である。HLA一致非血縁者間移植を受けた患者の7割にHLA-DP不適合が発生する。この不適合HLA-DP型分子に特異的な抗体を作成し、キメラ抗原受容体へ利用する。初年度はハイブリドーマ産生に用いるマウス骨髄腫細胞にCD64分子が発現するようにし、狙った抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞のみが蛍光で染色されるようにした。以上の条件設定に基づき、HLA-DPB1*09:01／DPA1*02:01（以下DPB9A2）ヘテロダイマーでのBalb/cマウス免疫を開始した。免疫条件として、(1) DPB9A2発現マウスNIH3T3細胞のみで3回免疫法、(2) DPB9A2発現細胞で2回＋DPB9A2精製蛋白で1回の組み合わせ法、(3) DPB9A2精製蛋白で3回法の3方法を試みた。(1)ではマウス血清にはHLA-DP分子のみならず、同じクラスII型HLA分子であるHLA-DR、-DQに対する抗体も同等に産生された。(3)では抗体価が著しく低く、免疫が不十分と判明した。（2）ではHLA-DR, -DQへの反応も出るものの、よりHLA-DPへの反応が強くなったため、以後の実験は（2）の組み合わせ法を用いた。モデル実験と同様にCD64を強制発現できるようにしたハイブリドーマを作成して、免疫に用いたDPB9A2蛋白にPE、HLA-DR/DQミックス蛋白にAPCを標識しハイブリドーマの表現形質を解析したところ、44％が双方とも陰性、22％が双方とも陽性、32％がHLA-DR/DQに陽性、1.3％がDPに陽性となった。このDP陽性ハイブリドーマをソーティングして増殖させたところ4クローンが得られ、うち2つはHLA-DR/DQミックス蛋白よりもDPB9A2に対して有意な反応性を示すことが確認出来た。

这项研究的目的是开发移植后复发性白血病的预防和治疗，这是同种异体造血细胞移植的主要原因。 HLA-DP不兼容发生在70％的接受HLA匹配的非相关移植的患者中。制备对这种不兼容的HLA-DP型分子特异的抗体，并用于嵌合抗原受体。在第一年，在用于杂交瘤产生的小鼠骨髓瘤细胞中表达CD64分子，并且仅用荧光光染色了产生特定于靶抗原抗体的抗体的杂交瘤细胞。基于上述条件，使用HLA-DPB1*09：01/DPA1*02：01（以下称为DPB9A2）的BALB/C小鼠免疫。作为免疫学条件，尝试了三种方法：（1）仅使用表达DPB9A2的小鼠NIH3T3细胞的三次免疫方法，（2）使用DPB9A2表达细胞的两次组合方法，再加上DPB9A2-纯化的蛋白质，以及与DPB9A2-PURIDIDER蛋白二次使用DPB9A2-纯化的蛋白质。在（1）中，不仅在小鼠血清中产生了HLA-DP分子，还同时生产了与同一II类HLA分子，HLA-DR和-DQ的抗体。（3）表明抗体滴度明显较低，免疫力不足。尽管（2）也对HLA-DR和-DQ做出了反应，但对HLA-DP的反应变得更强烈，因此在以下实验中使用了组合方法（2）。以与模型实验相同的方式，创建了允许CD64强制表达的杂交瘤，并且使用用于免疫的DPB9A2蛋白标记APC，并使用APC标记用于免疫的DPB9A2蛋白，并分析了杂化瘤的表型特征。 44％均为阴性，22％均为正，32％的HLA-DR/DQ为阳性，而DP的1.3％为阳性。对DP阳性杂交瘤进行分类并生长以获得4个克隆，其中两个被证实比HLA-DR/DQ混合蛋白表现出对DPB9A2的反应性明显更高。