血清グライコミクスを用いた糖鎖腫瘍マーカーの同定と多項目同時診断システムの構築

血清糖组学鉴定聚糖肿瘤标志物及多项目同时诊断系统的构建

基本信息

批准号：
21K07409
负责人：
岡本三紀
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Osaka International Cancer Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07409/
关键词：
腫瘍マーカー糖鎖 HPLC MS 質量分析

项目摘要

生体内の多くの血清タンパク質は糖鎖修飾を受け、その糖鎖構造の一部は腫瘍マーカーとして利用されている。また、血清中には遊離糖鎖も存在するが、すみやかに尿中へと排出される。本研究は、これらの糖鎖を標的にHPLC-basedグライコミクス解析を行い、従来法では検出されなかった腫瘍マーカーを新たに見出し、複数マーカーを用いた質量分析による新たながん診断システムの開発を目的としている。がん患者および健常人のHPLC糖鎖プロファイルを作成するために、血清糖たんぱく質から切り出した糖鎖を蛍光標識し、多段階HPLCで溶出分離する。N型糖鎖の解析にはその切断酵素PNGase Fがよく用いられる。一方、O型糖鎖は切り出す酵素がないため、化学的に切断する方法が利用されるが、同時に多量のN型糖鎖も切り出されてしまう。そのため、順相HPLCではN型糖鎖と伸長したO型糖鎖の溶出位置が重なり、圧倒的に量の多いN型糖鎖に埋もれて検出が難しい。そこで全てのO型糖鎖を検討対象とするため、血清N型糖鎖を先に酵素で切り出し分離してから、O型糖鎖を抽出精製する方法の検討を行った。確立した方法を用いて血清をrapid PNGase Fで反応させた後、糖タンパク質と遊離N型糖鎖を分離し、糖タンパク質からO型糖鎖を遊離させた。ほとんどのN型糖鎖とO型糖鎖の分離が可能であったが、糖鎖構造の詳細な解析によりO型糖鎖のソースであるムチンの回収率が安定していないことが示唆された。おそらくムチンの糖鎖修飾に依存した回収率となり、検体ごとにばらつきが予測されたため、O型糖鎖回収方法を再検討した。また、質量分析を用いた多項目同時測定は、尿検体から抽出したPA化糖鎖mixtureを用い、複数糖鎖構造の同時測定を検討した。

许多血清蛋白在体内发生糖基化，其中一些糖链结构被用作肿瘤标志物。此外，尽管血清中存在游离糖链，但它们很快就会排泄到尿液中。在这项研究中，我们将针对这些糖链进行基于HPLC的糖组学分析，发现传统方法无法检测到的新肿瘤标志物，并利用多种标志物的质谱法开发新的癌症诊断系统。为了创建癌症患者和健康个体的 HPLC 聚糖谱，对从血清糖蛋白中切下的聚糖进行荧光标记，并使用多步 HPLC 进行洗脱和分离。切割酶 PNGase F 通常用于分析 N-聚糖。另一方面，由于没有酶可以切掉O-聚糖，因此采用化学裂解方法，但同时也切掉了大量的N-聚糖。因此，在正相HPLC中，N-聚糖和延伸的O-聚糖的洗脱位置重叠，由于它们被绝大多数的N-聚糖掩埋，使得检测变得困难。因此，为了将所有O-聚糖纳入研究，我们研究了一种方法，其中首先使用酶切除并分离血清N-聚糖，然后提取并纯化O-聚糖。使用既定方法将血清与快速 PNGase F 反应后，分离糖蛋白和游离 N-聚糖，并从糖蛋白中释放 O-聚糖。尽管可以分离大多数 N-聚糖和 O-聚糖，但对聚糖结构的详细分析表明，O-聚糖来源粘蛋白的回收率并不稳定。回收率可能取决于粘蛋白的糖基化，并且预计不同样品的回收率会有所不同，因此我们重新考虑了 O-聚糖回收方法。此外，为了使用质谱法同时测量多个项目，我们研究了使用从尿液样本中提取的PA聚糖混合物同时测量多个聚糖结构。

项目成果

期刊论文数量（10）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

がん患者尿中におけるD-arabinose付加遊離N型糖鎖の同定

癌症患者尿液中添加 D-阿拉伯糖的游离 N-聚糖的鉴定

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
岡本三紀;半澤健;村上博子;谷口直之;宮本泰豪
通讯作者：
宮本泰豪

Identification of β1-3 galactosylglucose-core free-glycans in human urine

人尿液中 β1-3 半乳糖基葡萄糖核心游离聚糖的鉴定

DOI：
10.1016/j.ab.2021.114427
发表时间：
2022
期刊：
Analytical Biochemistry
影响因子：
2.9
作者：
Tanaka-Okamoto Miki;Hanzawa Ken;Murakami Hiroko;Mukai Mikio;Miyamoto Yasuhide
通讯作者：
Miyamoto Yasuhide

尿中遊離糖鎖の検出と疾患マーカーとしての可能性

尿液中游离糖链的检测及其作为疾病标志物的潜力