尿中遊離糖の腫瘍マーカー探索と臨床応用に向けた定量法の確立

探索尿游离糖肿瘤标志物并建立临床应用定量方法

基本信息

批准号：
22K15700
负责人：
半澤健
金额：
$ 3万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

以前に行った、がんにおける比較的小さな尿中遊離糖鎖の変化に関する研究に引き続いて、より大きな構造の糖鎖に着目した腫瘍マーカー候補の探索を進めた。これまでに、健常者においてごく微量あるいは検出限界以下のシアリル化された多分枝（3, 4本鎖）糖鎖が、がん患者において増加傾向を示すことを確認している。基本的な多分枝糖鎖に関しては、酵素・化学修飾処理により分枝とシアル酸の結合様式まで解析を進められている。一方、分枝に加えて末端部に伸長構造を有すると推定される糖鎖も検出されているが、現状は質量による組成のみが判明している。また、分析手法の改良に関する検討も行った。収率評価のための内部標準として添加するための糖鎖として、天然にはほぼ存在しないと考えられる単糖残基を部分構造として組み込み、かつ天然糖鎖と性質が類似した合成オリゴ糖を設計した。さらに、微量な糖鎖のLC/MS検出安定性を高めるための感度の向上実験も行った。結果として、水リッチな逆相HPLC/MS(/MS)において、元の流速と同程度の揮発性有機溶媒または元の流速の0.2～2%程度の揮発性弱酸をポストカラム添加することにより、カラムにおける糖鎖分離に影響を与えずにポジティブモードにおける糖鎖の感度を1.5～2.5倍程度増加させることができた。これによりスプレーの安定性も増したためMS/MS定量測定値の再現性も向上した。一方で、特にシアル酸残基を4つ以上有する糖鎖およびリン酸基を有する酸性糖鎖は、精製度を高めるための複数回のHPLC分離を行うと収率が大きく低下することを確認している。これらの糖鎖はHPLCのカラム・配管に金属イオン不純物を介して吸着しやすいとされ、これによりクロマトグラムのピーク形状が悪くなりやすく（感度が低い・キャリーオーバーしやすい）、したがって定量分析を進めていくうえで改善すべき課題と考えられた。

在先前对癌症中相对较小的无尿聚糖变化的研究之后，我们继续寻找针对较大聚糖结构的潜在肿瘤标志物。迄今为止，已经证实，健康个体中的大量分支（3-4链）聚糖表现出越来越多的癌症患者趋势。通过酶和化学修饰处理，已经分析了基本的多支糖链与分支和唾液酸的结合模式。另一方面，除分支外，还发现了糖链在末端部分具有延伸结构，但目前已经揭示了基于质量的组成。我们还研究了分析方法的改进。将合成的寡糖设计为单糖残基的部分结构，被认为几乎是非自然地发生的糖链，作为添加的糖链，作为内部标准，以进行产量评估，并且在性质上与天然糖链相似。此外，我们还进行了一项实验，以提高灵敏度，以提高LC/MS检测量的糖链的稳定性。结果，在水丰富的相反相HPLC/MS（/MS）中，通过在与原始流速的原始流速或挥发性弱酸相同的水平上添加挥发性有机溶剂，约为原始流量的0.2-2％，糖链在正模式下的敏感性可能会增加约1.5-2.5次，而不会影响1.5-2.5次。这也提高了喷雾的稳定性，并提高了定量MS/MS测量值的可重复性。另一方面，已经证实，当多次进行HPLC以提高纯化程度时，具有四个或多个唾液酸残基和具有磷酸基团的酸性糖链的糖链的产量会显着降低。据说这些糖链很容易通过金属离子杂质吸附到HPLC色谱柱和管道上，这使得色谱图的峰形更可能恶化（低灵敏度且易于携带），因此在进行定量分析时被认为可以改善问题。