エンドサイトーシスを引き起こす内在性分子群の多色超解像マップの作成

创建引起内吞作用的内源分子群的多色超分辨率图

• 批准号: 21K06168
• 负责人: 木内 泰
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06168/
• 关键词: 超解像イメージング; エンドサイトーシス; EGF受容体

細胞底面のクラスリン被覆部位では、Clathrin heavy chainやClathrin light chain、AP2 complex、FCHo1/2、Eps15、ITSNといったタンパク質によって構造が形成・維持され、EGF受容体やトランスフェリン受容体といった膜受容体のエンドサイトーシスが引き起こされる。これらの分子群の空間的な関係性は、光の回折限界以下の領域であるため、電子顕微鏡や超解像顕微鏡法で観察されてきた。しかし、これらの多種のタンパク質の同一部位での多色観察は難しく、主には１～２種類の標的タンパク質の観察結果を平均化することでクラスリン被覆部位の構造は研究されてきた。本研究では、多種類のタンパク質を同一細胞で連続多重染色できる超解像顕微鏡法IRIS（Kiuchi et al., Nat. Methods, 2015）を用いて、クラスリン被覆部位に集積する内在性の分子群の観察を行った。内在性の標的分子を観察するために抗体由来の結合解離プローブの作製方法を確立し、多色超解像観察に成功した。その結果、クラスリン被覆部位では、それぞれの標的分子が、乱雑に分布しているのではなく、被覆部位の縁や中心部位に傾向をもって分布している様子が観察された。しかし、縁や中心部内の微小領域では、標的分子間の位置関係は、多様で複雑であることが明らかになった。この微小領域でのタンパク質の配置は、クラスリン被覆部位の形成や崩壊、エンドサイトーシスといった機能との関係が考えられる。また標的タンパク質への結合能を変え、迅速に解離するようにした改変抗体の作製方法をCell Reports Methods（Zhang et al., 2022）に報告した。

在细胞底部的网格蛋白涂料位点，结构由蛋白质（例如网状蛋白重链，网格蛋白轻链，AP2复合物，FCHO1/2，EPS15和ITS）形成和维持，从而导致膜受体的内吞作用，例如EGF受体和转移蛋白受体。这些分子之间的空间关系位于低于光的衍射极限的区域，已经通过电子显微镜和超分辨率显微镜观察到。但是，很难在这些各种蛋白质的同一部位观察多色，并且主要通过平均一种或两种类型的靶蛋白观测结果来研究网格蛋白涂料位点的结构。在这项研究中，我们观察到使用超分辨率显微镜虹膜在网格蛋白涂层位点积聚的内源分子（Kiuchi等，Nat。Methots，2015），允许多种类型的蛋白质在同一细胞上连续染色。为了观察内源性靶标分子，建立了一种准备抗体衍生的结合解离探针的方法，并成功地观察了多色超分辨率观察。结果，观察到网格蛋白涂料位点的靶分子没有混乱，而是以涂层位点的边缘和中心位点的趋势分布。但是，在边缘和中心的微区域中，目标分子之间的位置关系已被证明是多种多样且复杂的。在该微层中，蛋白质的排列可能与网格蛋白涂层位点的形成，破坏和内吞作用等功能有关。此外，在细胞报告方法中报道了一种改变其与靶蛋白结合的能力并允许快速解离的方法的方法（Zhang等，2022）。