糖鎖構造リモデリングによるEGFレセプターのエンドサイトーシスの制御

通过聚糖结构重塑调节 EGF 受体内吞作用

• 批准号: 13770058
• 负责人: 高橋 素子
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770058/
• 关键词: 糖転移酵素; GnT-III; EGFシグナリング; EGF受容体; エンドサイトーシス

本研究ではCHO-HER細胞にGnT-III遺伝子を導入することによって、EGFシグナル経路や受容体のエンドサイトーシスにどのような変化が起こるかを検討した。^<125>I-EGFを用いたリガンド結合実験によって、GnT-III導入細胞ではEGF受容体のうち低親和性のものが減少することがわかった。またGnT-III導入細胞では受容体のエンドサイトーシスが亢進することが明らかとなった。そこで糖鎖の改変したEGF受容体を精製し解析するため、EGF受容体にHis-tagをつけたものをCHO細胞に導入し、CHO-HER(His)細胞を確立した後GnT-III遺伝子を導入した。この細胞抽出液より金属キレートカラムと抗体カラムを用いることによってEGF受容体を精製した。現在、この精製物と人工脂質重膜を用いて細胞膜を再構成することを試みている。また一方で、EGFRをGFPにて蛍光ラベルし、GnT-IIIを同時にCHO細胞に導入したものを用いて一分子解析を試みている。

在这项研究中，我们研究了如何将GNT-III基因引入Cho-Her细胞中，从而导致EGF信号通路和受体内吞作用的变化。使用I-EGF的配体结合实验表明，在GNT-III-TRANSDONDS.细胞中，EGF受体之间的低亲和力降低。还表明，GNT-III细胞中受体内吞作用增加。因此，为了净化和分析用糖改变的EGF受体，将带有HIS-TAG的EGF受体引入了CHO细胞中，并建立了Cho-Her（His）细胞并引入了GNT-III基因。使用金属螯合柱和抗体柱从细胞提取物中纯化EGF受体。目前，我们正在尝试使用这种纯化的产品和人造脂质层膜来重建细胞膜。另一方面，使用与GFP和GNT-III的EGFR荧光标记一起尝试了一种分子分析，并同时引入了CHO细胞。

项目成果

Shibukawa Y., Takahashi M.et al.: "Downregulation of hydrogen peroxide-induced PKCd activation in N-acetylglucosaminyltransferase III transfected HeLaS3 cells"J.Biol.Chem.. (in press). (2003)

Shibukawa Y.、Takahashi M.等人：“N-乙酰葡糖胺基转移酶 III 转染的 HeLaS3 细胞中过氧化氢诱导的 PKCd 激活的下调”J.Biol.Chem..（出版中）。

Kon YH.et al.: "Osmotic stress induces HB-EGF gene expression via Ca(2+)/Pyk2/JNK signal cascades in rat aortic smooth muscle cells"J.Biochem.. 130. 351-358 (2001)

Kon YH.et al.：“渗透应激通过大鼠主动脉平滑肌细胞中的 Ca(2)/Pyk2/JNK 信号级联诱导 HB-EGF 基因表达”J.Biochem.. 130. 351-358 (2001)

Kobayashi T.et al.: "Localization and physiological implication of aldose reductase and sorbitol dehydrogenase in reproductive tracts and spermatozoa of male rats"J.Andorlogy. 23. 674-683 (2002)

Kobayashi T.等人：“醛糖还原酶和山梨醇脱氢酶在雄性大鼠生殖道和精子中的定位和生理学意义”J.Andorlogy。

Laffont I., Takahashi M.et al.: "Apolipoprotein E activates Akt pathway in neuro-2a in an isoform-specific manner"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 292. 83-87 (2002)

Laffont I.、Takahashi M.等人：“载脂蛋白 E 以异构体特异性方式激活神经 2a 中的 Akt 通路”Biochem.Biophys.Res.Commun.. 292. 83-87 (2002)

Sato Y., Takahashi M., et al.: "Overexpression of N-Acetylglucosaminyltransferase III enhances the EGF-induced phophorylation of ERK in HeLaS3 cels by upregulation of the internalization rate of the receptors"J.Biol.Chem.. 276. 11956-11962 (2001)

Sato Y.、Takahashi M. 等人：“N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 III 的过表达通过上调受体的内化率增强 HeLaS3 细胞中 EGF 诱导的 ERK 磷酸化”J.Biol.Chem.. 276. 11956