Time-resolved XFEL crystallography for DNA photolyase

DNA 光裂合酶的时间分辨 XFEL 晶体学

基本信息

批准号：
21K06042
负责人：
別所義隆
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

ＤＮＡフォトリアーゼは、紫外線曝露により生じるＤＮＡピリミジン二量体の損傷を修復する酵素である。その反応には可視の青色光のエネルギーを必要としており、光回復酵素として知られている。この研究では、この酵素の光回復反応において、分子間反応のダイナミクスを構造化学的に明らかにすることを目的とする。我々は、古細菌Methanosarcina mazeiのクラスII-CPDフォトリアーゼ（MmCPDII）をターゲット酵素に選定した。この酵素は、高分解能のＸ線結晶構造が既に報告されており、また分光学的特徴もよく知られているのでこの研究に最適な材料である。今年度、ＸＦＥＬ実験で使用する液体ジェット噴出装置の規格に合うように、MmCPDII単体のマイクロ結晶を作成する条件を検討した。結晶化のタンパク質濃度と温度条件を最適化することにより、80μmサイズの結晶を大量に作成することに成功した。この結晶を用いて、SACLAのXFELと同じビームサイズのＸ線を作り出せるSPring-8マイクロフォーカスビームラインBL32XUにて照射実験を行い、高分解能のＸ線回折が得られることを確認した。次に、結晶中で酵素反応が進まないように嫌気的条件で結晶化させる技術を開発した。MmCPDII中に内包されるフラビン補酵素のスペクトルを計測することで、結晶中の酵素分子が還元型を保つ条件を見出した。BL32XUビームラインによる測定で、嫌気条件結晶に「グリース」を充填剤として使うことで、回折の減衰が抑えられることが確認された。この条件でMmCPDIIのマイクロ結晶を再度準備し、SACLAのBL2ビームラインにて液体ジェット装置から噴出させXFELを照射した。多数のマイクロ結晶から回折データを取得し、解析の結果、還元型結晶構造の初期モデルを構築できた。

DNA 光裂解酶是一种修复由紫外线照射引起的 DNA 嘧啶二聚体损伤的酶。该反应需要可见蓝光的能量，被称为光活化酶。本研究的目的是从结构上阐明该酶的光活化反应中分子间反应的动力学。我们选择古菌 Methanosarcina mazei 的 II-CPD 光解酶（MmCPDII）作为目标酶。这种酶是这项研究的理想材料，因为它的高分辨率 X 射线晶体结构已经被报道，并且它的光谱特征是众所周知的。今年，我们研究了制造 MmCPDII 微晶的条件，以满足 XFEL 实验中使用的液体喷射装置的规格。通过优化结晶的蛋白质浓度和温度条件，我们成功生产了大量的80μm晶体。使用该晶体，我们在SPring-8微焦点光束线BL32XU上进行了照射实验，该光束可以产生与SACLA的XFEL相同光束尺寸的X射线，并证实可以获得高分辨率的X射线衍射。接下来，他们开发了一种在厌氧条件下结晶的技术，以防止酶促反应在晶体中进行。通过测量MmCPDII中所含黄素辅酶的光谱，我们发现了晶体中酶分子保持还原形式的条件。 BL32XU 光束线的测量证实，通过使用“油脂”作为厌氧晶体中的填料可以抑制衍射衰减。在这些条件下，再次制备MmCPDII微晶，从SACLA的BL2光束线的液体喷射装置中喷射出来，并用XFEL进行照射。从大量微晶体中获得衍射数据，并根据分析结果，构建了简化晶体结构的初始模型。

项目成果

期刊论文数量（7）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

XFEL analyses of molecular mechanism and structure in DNA photolyase photoreduction.

XFEL 分析 DNA 光解合酶光还原的分子机制和结构。

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
Quan X.;Numoto N.;Tsubata T.;Ito N.;Yoshitaka Bessho
通讯作者：
Yoshitaka Bessho

Flavin photoreduction mechanism in a DNA photolyase.

DNA 光裂合酶中的黄素光还原机制。

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
沼本修孝，全熙斌，鍔田武志，伊藤暢聡;Yoshitaka Bessho
通讯作者：
Yoshitaka Bessho

Academia Sinica, Taiwan(その他の国・地域)

台湾中央研究院（其他国家/地区）

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

メタノサルキナDNA光回復酵素のXFEL時分割構造解析

甲烷沙奎纳 DNA 光激活酶的 XFEL 时间分辨结构分析

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
沼本修孝，全熙斌，鍔田武志，伊藤暢聡;Yoshitaka Bessho;別所義隆
通讯作者：
別所義隆

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在 tRNA 56 位形成 2-O-甲基胞苷的独特 SpoU 家族古菌甲基化酶的晶体结构和突变研究

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
Journal of Molecular Biology 375巻・4号
影响因子：
0
作者：
倉谷光央;別所義隆;西本まどか;Henri Grosjean;横山茂之
通讯作者：
横山茂之

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DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
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通讯作者：
斉藤稔

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DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
倉谷光央;吉川由香;別所義隆;東島今日子;石井健;柴田理恵;高橋征三;油谷克英;横山茂之;倉谷光央;Takeshi Haraguchi;Nobutake Yamamichi;Takeshi Haraguchi;Shuji Fujita;原口健;原口健
通讯作者：
原口健