Research for the three-dimensional culture of porcine spermatogonial stem cells (SSCs) and the perfusion organ culture of testicular organoids.

猪精原干细胞（SSC）三维培养及睾丸类器官灌注器官培养研究。

基本信息

批准号：
21K05904
负责人：
高木優二
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は単離したブタのセルトリ細胞と精子幹細胞を、人為的に３次元的な精細管環境を再現することにより、幹細胞ニッチを再構築し、体外で幹細胞を増殖させることを目的とする。2022年度は以下のことを明らかにした。1.ブタ精巣からのセルトリ細胞の単離方法の再検討昨年度から課題であった精巣からのセルトリ細胞の単離が予想以上に困難であった。幼若期から成熟期まで利用できる細胞表面マーカーが無く、しかも高純度でより多くのセルトリ細胞を必要とするためである。そこでOptiPrep密度勾配遠心法を用いて分画精度とスケールアップを中心に検討を行った。まず精巣より生存率の高い採取法と採取した細胞懸濁液からの死細胞除去の必要性を明らかにした。分画精度を上げるために、OptiPrepの密度勾配を非連続密度勾配から連続密度勾配に変更し、より短時間で容易に勾配層を作れる手法を確立した。密度勾配遠心後の細胞の回収には、ステッピングモーターを用いた細胞層の採取とCNCフライス盤を活用した24well培養皿フラクションコレクターの自作により実施できるようにした。これらの再検討により純度の高いより多くの細胞を取り扱えるようになった。2微小ペリスタポンプを用いた灌流器官培養装置の改良昨年度に作製した灌流器官培養装置をさらに小型化してより多くの灌流装置を一度に培養できる装置に改良した。また通気性EVAフィルムは滅菌方法に難点があったため、高圧滅菌操作に耐えうるフィルムを入手するとともに、培養装置に組み込んだ。精巣より精細管のみを採取し、同装置で精細管の器官培養条件について検討を行った。さらに3Dプリンターの活用により、作製した部品を鋳型に高圧滅菌可能な資材に変更することでコンタミの頻度を低減することが出来た。

这项研究旨在通过人为地再现分离的猪的三维会计肾小管环境来重建干细胞生态位和增殖干细胞。在2022财政年度：1。从猪睾丸中分离出Sertoli细胞从睾丸中分离出Sertoli细胞的方法的重新审查，这是自去年以来的挑战，这比预期的要难得多，这是一个挑战。这是因为从少年到成熟的阶段没有可用的细胞表面标记，并且还需要更多具有较高纯度的Sertoli细胞。因此，我们进行了一项研究，重点是使用OptiPREP密度离心的分馏准确性和扩展。首先，我们阐明了对收集方法的需求，该方法的存活率高于睾丸，并从收集的细胞悬浮液中去除死细胞。为了提高分级精度，我们建立了一种方法，可以通过将密度梯度从非连续密度梯度更改为连续密度梯度，从而在较短的时间内轻松形成梯度层。密度梯度离心后的细胞收集可以通过使用步进电动机收集细胞层，并通过使用CNC铣床使用24孔培养皿分数收集器来进行细胞层。这些重新检查使我们能够处理更高纯度的更多细胞。 2使用微型泵改进的灌注器官培养装置，去年创建的灌注器官培养装置的尺寸进一步降低，并改进到可以立即培养更多灌注设备的装置。此外，由于灭菌方法对透气的EVA膜有缺点，因此可以获得可以承受高压灭菌操作并将其纳入培养装置的膜。仅从睾丸中收集了生精的小管，并使用同一装置检查了生精小管的器官培养条件。此外，通过使用3D打印机，通过将制造的零件改为可以消毒的材料来降低污染的频率。

项目成果

期刊论文数量（2）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

ブタ精子への100MPa加圧における卵黄の保護効果

蛋黄对猪精子施加100MPa压力的保护作用

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
高月颯;小林吉倫;濱野光市;古屋元宏;藤田智之;髙木優二
通讯作者：
髙木優二

トリプシン処理したブタ精巣細胞のタイムラプス観察

胰蛋白酶处理的猪睾丸细胞的延时观察

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Mizuki Kusumoto;Yuka Kanao;Haruka Narita;Makoto Jitsuiki;Keita Iyori;Manami Tsunoi;Yuzo Tsuyuki;Kae Torii;and Kazuki Harada;保坂謙，諸白家奈子，濱野光市，高木優二
通讯作者：
保坂謙，諸白家奈子，濱野光市，高木優二