細胞老化過程におけるゲノム構造変化のヌクレオソームレベルでの理解

在核小体水平上了解细胞衰老过程中的基因组结构变化

基本信息

批准号：
21K05512
负责人：
大野雅恵
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、老化前後の出芽酵母に対してHi-CO解析を行うことで、老化に伴うゲノム構造変化をヌクレオソーム・遺伝子・染色体のレベルでとらえることを目的とする。そこで、対数増殖期の酵母、および老化細胞として長期培養し増殖静止期に入った酵母を用いた。Hi-CO法では、化学固定した酵母をMicrococcal nuclease (MNase) で処理し、ゲノムをヌクレオソームサイズに切断した後に、DNAアダプターをヌクレオソーム上のゲノムDNAに結合させ、このアダプター同士を結合させることで空間的に近い位置にあるヌクレオソーム同士を連結する。この連結したゲノム配列を次世代シークエンサーを用いて解読することで、ヌクレオソーム同士の空間的な距離を調べる。増殖期と静止期の酵母では、細胞壁の厚さやクロマチンのアクセシビリティが異なる。そのため、細胞壁破砕やMNase処理条件などのHi-CO法における各ステップを、増殖期と静止期のそれぞれの酵母において最適化する必要があった。また、最終産物である連結したヌクレオソームの収量が低いことが問題としてあったため、この点を改善するために、使用する酵素の変更や、DNAアダプターの配列を変更することで、Hi-CO法の各ステップの改良を行いヌクレオソームの連結効率を上げる検討を試みた。その結果、ヌクレオソーム同士の連結率を上昇させることができた。これら条件検討・改良を行った後に、老化した酵母を用いてHi-CO解析を実施した。

在这项研究中，应通过对衰老前后的胚芽酵母进行HI-COO分析来考虑与衰老相关的基因组结构变化的目的。因此，对数增殖期的酵母以及已在长期培养的衰老细胞中培养的酵母，并已进入增殖期。在HI-CO方法中，将化学固定的酵母与微球菌核酸酶（MNase）一起处理，将基因组切成核体大小，然后将DNA衔接子与核小体上的基因组DNA结合，并将此适配器相互连接Nukureo靠近位置。通过使用下一代序列对这种连接的基因组序列解密，可以检查核小体之间的空间距离。在此期间的生长期和酵母中，细胞壁的厚度和染色质的可及性不同。因此，有必要优化HI-CO方法中的每个步骤，例如细胞壁粉碎和MNase加工条件，在增殖的生长和酵母中，以及相位静止。另外，由于最终产物的合并核小体的低屈服是通过更改所使用的酶并改变DNA适配器序列的问题，这是一个问题提高每个步骤以提高nukureo的连接效率。结果，核小体之间的合并速率可以增加。在检查和改善了这些条件后，使用衰老酵母进行了HI-CO分析。