Exploration and biochemical characterization of novel regulatory mechanisms of bacterial glutamate dehydrogenases

细菌谷氨酸脱氢酶新调控机制的探索和生化表征

基本信息

批准号：
21K05358
负责人：
富田武郎
金额：
$ 2.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

グルタミン酸脱水素酵素GDHはグルタミン酸と2-オキソグルタル酸の可逆的変換を触媒する酵素であり、ほとんど全ての生物において炭素・窒素代謝の恒常性の維持において重要な役割を果たしている。我々は以前に好熱菌Thermus thermophilus由来のGDH (TtGDH)が複雑なアロステリック活性化を受けることを発見した。本研究では、このGDHの活性化の構造基盤を明らかにする共に、別の微生物のGDHにおける新奇活性調節機構を探索し、細胞内機能を解明することを目指した。TtGDH複合体のクライオ電顕解析を行い、3.6Å分解能のデータを得た。最終年度はこのデータに基づき各コンポーネントの間の相互作用部位の変異体解析を行った。その結果、これらのタンパク質の間の特定のイオン結合が相互作用の鍵となっていることが明らかとなった。また、我々は分裂酵素の2種類のGDHに着目した。そのうち一つのSpGDH1はNADPH依存型酵素である。我々は、SpGDH1の補酵素・基質複合体の結晶構造を決定し、補酵素認識機構を明らかにした。SpGDH1の補酵素特異性はリン酸化修飾により制御されている可能性が考えられた。リン酸化模倣変異体を解析したところ、補酵素特異性がシフトしていることがわかった。最終年度では、分裂酵母内で実際にSpGDH1がリン酸化されていることを確認するために、分裂酵母の組換え株を作製した。他方のSpGDH2はサブユニットのサイズが約115 kDaと大きいタイプのGDHである。コアGDHドメインの他に大きな機能未知ドメインを有していることなどから、複雑な調節機構が存在することが予想された。大腸菌を用いてSpGDH2の組換えタンパク質を調製し、その酵素活性を確認した。最終年度では、クライオ電顕解析により3.6Å分解能のデータを得て複雑なドメイン構造を形成していることが明らかになった。

谷氨酸脱氢酶GDH是一种酶，可催化谷氨酸和2-氧化甲酸的可逆转化率，并且在几乎所有生物中的碳和氮代谢的稳态中起着重要作用。我们先前发现，嗜热细菌嗜热细菌的GDH（TTGDH）经历复杂的变构激活。在这项研究中，我们旨在阐明GDH激活的结构基础，并探索其他微生物中GDH的新调节机制，并阐明细胞内功能。进行TTGDH复合物的冷冻电子显微镜分析，以获取分辨率为3.6Å的数据。在最后一年，根据此数据对每个组件之间的相互作用位点进行突变分析。结果表明，这些蛋白质之间的特定离子键是它们相互作用的关键。我们还专注于两种类型的GDH，一种有丝分裂酶。其中之一，SPGDH1是NADPH依赖性酶。我们确定了SPGDH1的辅酶 - 基底复合物的晶体结构，并揭示了辅酶识别机制。据认为，SPGDH1的辅酶特异性可以通过磷酸化修饰来调节。磷酸化突变体的分析表明辅酶特异性发生了变化。在最后一年，产生了裂变酵母的重组菌株，以确认SPGDH1实际上在裂变酵母中被磷酸化。另一个SPGDH2是一种大型GDH，亚基尺寸约为115 kDa。除了核心GDH结构域外，还可以预计会有复杂的调节机制。使用大肠杆菌制备SPGDH2的重组蛋白，并确认其酶活性。在最后一年，冷冻电子显微镜分析显示，获得了3.6Å分辨率的数据，并形成了复杂的域结构。