Exploration and biochemical characterization of novel regulatory mechanisms of bacterial glutamate dehydrogenases

细菌谷氨酸脱氢酶新调控机制的探索和生化表征

基本信息

批准号：
21K05358
负责人：
富田武郎
金额：
$ 2.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

グルタミン酸脱水素酵素GDHはグルタミン酸と2-オキソグルタル酸の可逆的変換を触媒する酵素であり、ほとんど全ての生物において炭素・窒素代謝の恒常性の維持において重要な役割を果たしている。我々は以前に好熱菌Thermus thermophilus由来のGDH (TtGDH)が複雑なアロステリック活性化を受けることを発見した。本研究では、このGDHの活性化の構造基盤を明らかにする共に、別の微生物のGDHにおける新奇活性調節機構を探索し、細胞内機能を解明することを目指した。TtGDH複合体のクライオ電顕解析を行い、3.6Å分解能のデータを得た。最終年度はこのデータに基づき各コンポーネントの間の相互作用部位の変異体解析を行った。その結果、これらのタンパク質の間の特定のイオン結合が相互作用の鍵となっていることが明らかとなった。また、我々は分裂酵素の2種類のGDHに着目した。そのうち一つのSpGDH1はNADPH依存型酵素である。我々は、SpGDH1の補酵素・基質複合体の結晶構造を決定し、補酵素認識機構を明らかにした。SpGDH1の補酵素特異性はリン酸化修飾により制御されている可能性が考えられた。リン酸化模倣変異体を解析したところ、補酵素特異性がシフトしていることがわかった。最終年度では、分裂酵母内で実際にSpGDH1がリン酸化されていることを確認するために、分裂酵母の組換え株を作製した。他方のSpGDH2はサブユニットのサイズが約115 kDaと大きいタイプのGDHである。コアGDHドメインの他に大きな機能未知ドメインを有していることなどから、複雑な調節機構が存在することが予想された。大腸菌を用いてSpGDH2の組換えタンパク質を調製し、その酵素活性を確認した。最終年度では、クライオ電顕解析により3.6Å分解能のデータを得て複雑なドメイン構造を形成していることが明らかになった。

谷氨酸脱氢酶GDH是一种催化谷氨酸和2-酮戊二酸可逆转化的酶，在维持几乎所有生物体的碳氮代谢稳态中发挥着重要作用。我们之前发现来自嗜热栖热菌 (TtGDH) 的 GDH 经历复杂的变构激活。在本研究中，我们旨在阐明GDH激活的结构基础，探索GDH在其他微生物中的新型活性调节机制，并阐明其细胞内功能。我们对 TtGDH 复合物进行了冷冻电镜分析，并获得了分辨率为 3.6 Å 的数据。在最后一年，我们根据这些数据分析了每个组件之间的交互位点。结果表明，这些蛋白质之间的特定离子键是它们相互作用的关键。我们还关注了两种类型的 GDH，即裂变酶。其中之一 SpGDH1 是一种 NADPH 依赖性酶。我们确定了SpGDH1辅酶-底物复合物的晶体结构，并阐明了辅酶识别机制。据认为，SpGDH1的辅酶特异性可能是通过磷酸化修饰来控制的。对拟磷突变体的分析揭示了辅酶特异性的变化。去年，我们创建了裂殖酵母的重组菌株，以确认 SpGDH1 在裂殖酵母中实际上被磷酸化。另一种类型的 GDH，SpGDH2，具有约 115 kDa 的大亚基。由于除了核心GDH结构域外，它还具有功能未知的大结构域，因此预测存在复杂的调节机制。我们利用大肠杆菌制备了重组SpGDH2蛋白并证实了其酶活性。最后一年，通过冷冻电镜分析获得了分辨率为3.6 Å的数据，并揭示了形成了复杂的域结构。