Development of a novel detection method for whole bacterial cells using bacteriophages as recognition elements

开发一种以噬菌体为识别元件的全细菌细胞检测新方法

• 批准号: 21K05113
• 负责人: 渡辺 茂
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kochi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05113/
• 关键词: 蛍光性ナノエマルション; バクテリオファージ; 蛍光顕微鏡法; 細菌検出; 高輝度; 天敵ウイルス; 蛍光プローブ; 金ナノ粒子; 磁性ナノ粒子; 磁気分離; 暗視野顕微鏡法; 光散乱; プラウモニクス; ナノエマルション; 光機能性ナノ粒子

感染症を取り巻く環境は，細菌性食中毒の集団感染，院内感染の多発や新興・再興感染症の発生など多様化しており，早期診断・治療および二次感染の予防には迅速な微生物検査が不可欠である．宿主細菌に対して特異的に感染するバクテリオファージ（“天敵ウイルス”）を機能性ナノ粒子とハイブリッド化することでPCR法や免疫検出法に代わる新たな細菌検出技術への応用が期待できる．高感度かつ高選択的な細菌検出法の開発には，検体中，検出したい細菌にのみ結合し，その情報を我々が検出可能な物理信号に変換する蛍光プローブの開発が不可欠である．本年度は，ファージと蛍光性ナノエマルションを利用した細菌の蛍光検出法の開発について検討した．蛍光法を利用した高感度・高信頼性の細菌検出には，光安定性に優れ強力な蛍光を発する信号発信部位を有する蛍光プローブが求められる．これまでにファージの頭部に蛍光色素を結合させた蛍光プローブが開発されているが，輝度が低い上に光安定性にも欠ける．そこでオイルと界面活性剤からなる粒径が数十nmのナノエマルションに大量の蛍光色素を溶解させることで，光安定性に優れ高輝度な蛍光性ナノエマルションを開発した．次に表面にカルボキシル基を導入した蛍光性ナノエマルションを合成し，活性エステルへと導いた後，ファージとアミド結合を介して結合させることで蛍光性ナノエマルション修飾ファージを合成した．これを各種細菌と混合後，蛍光顕微鏡を用いて観察した．試料中の細菌がファージの宿主細菌（S.aureus）である場合，細菌から強力な蛍光が観察されたのに対して，宿主以外の細菌（E.coliなど）からは蛍光が観察されることがなく，蛍光性ナノエマルション修飾ファージを利用して，選択的に細菌を蛍光検出できることがわかった．

围绕传染病的环境正在多样化，例如细菌中毒的集体感染，频繁发生医院感染以及出现和重新出现的感染以及迅速的微生物以及微生物的发生对于预防早期诊断，治疗和次要感染至关重要。通过杂交造成细菌膜（“天然敌人病毒”），该薄膜专门感染了宿主细菌，可以预计将应用于取代PCR方法和免疫检测方法的新细菌检测技术。在开发高敏感性和高选择性细菌检测方法时，必须开发仅与被检测到的细菌结合并将这些信息转换为可以检测到的物理信号的荧光探针。今年，我们研究了使用粘液和荧光纳米群的细菌荧光检测方法的发展。为了使用荧光方法检测高灵敏度和高可靠性，需要具有良好光稳定性和强大荧光的信号传输位点的荧光探针。到目前为止，已经开发出一种将荧光色素与噬菌体头部结合在一起的荧光探针，但亮度较低，缺乏光稳定性。因此，通过将大量的荧光色素溶解在具有油和表面活性剂粒径的纳米膜中，我们开发了高亮度和高亮度荧光纳米 - 甲硅烷。接下来，通过将荧光纳米乳液与表面上的羧基合成，从而使荧光纳米平衡修饰噬菌体合成，从而导致活性酯，并通过噬菌体和酰胺键结合。与各种细菌混合后，使用荧光显微镜观察到它。如果样品中的细菌是噬菌体的噬菌体，则细菌已经观察到了强烈的荧光，而植物除了宿主以外的细菌（E.Coli等）观察到荧光。通过使用荧光纳米分解噬菌体选择性检测。

项目成果

バクテリオファージ修飾SiO2@AuNPコア-シェル型ナノ粒子を利用した細菌の暗視野顕微鏡検出

使用噬菌体修饰的 SiO2@AuNP 核壳纳米粒子对细菌进行暗场显微检测

• 发表时间: 2022
• 作者: 今井 斉志，仁子 陽輔，波多野 慎悟，渡辺 茂，内山 伊代，内山 淳平，松崎 茂展

バクテリオファージ由来の標的認識分子を利用した病原性細菌の金ナノ粒子凝集比色検出

使用噬菌体衍生的目标识别分子比色检测病原菌的金纳米颗粒聚集体

• 发表时间: 2022
• 作者: 綱澤彬仁，仁子陽輔，波多野慎吾，渡辺 茂

金属ナノ粒子，微粒子の合成，調製と最新応用技術 「金平糖型金ナノ粒子の作製と細菌検出技術の開発, 」

金属纳米颗粒和微米颗粒的合成制备及最新应用技术：“纸屑型金纳米颗粒的制备及细菌检测技术的开发”，

• 发表时间: 2021
• 作者: Funo Sota;Sato Fumikazu;Cai Zhiwei;Chang Gang;He Yunbin;Oyama Munetaka;渡辺 茂
• 通讯作者: 渡辺 茂