グラム陰性細菌の膜タンパク質挿入機構を模倣した人工細胞の創出

创建模拟革兰氏阴性细菌膜蛋白插入机制的人造细胞

• 批准号: 21J12786
• 负责人: 野場 考策
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-28 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J12786/
• 关键词: リポソーム; ボトムアップ合成生物学; 人工細菌; 微生物工学

当該の研究課題の達成のために、リポソーム膜の内葉及び外葉にそれぞれ異なるタンパク質を配向した細菌サイズのリポソーム創出を行った。目的達成のため、過去に報告されているリポソーム作成方法である、Oil in water emulsion法とExtruder法の組み合わせに着目した。これによりリポソーム膜内葉にベンジルグアニン基を修飾した脂質及びSNAP-GFPを、外葉にビオチン基を修飾した修飾脂質及びStreptavidin-Alexafluore 647を配向させた。得られたリポソームの粒子径分布を動的光散乱法による粒子径の評価により作成されたリポソームのサイズは直径1 μmであったため、細菌サイズのリポソームが作成できていることを確認した。また、フローサイトメトリーを用いてAlexafluore 647とSNAP-GFP両者の蛍光を評価したところ、膜内外で異なるタンパク質組成を持つ細菌サイズのリポソーム構築に成功したと考えられる。作成したリポソームがユニラメラであることが細菌の機能再現においても重要であるため、クライオ電子顕微鏡およびα-hemolysinを用いたラメラリティ評価を行ったところ、90%を超えるリポソームがユニラメラであることが明らかとなった。この結果は過去のリポソーム作成方法として知られるExtruder法と比較しても非常に高く、本手法で作成したリポソームは細菌の膜機能やその構造を高度に再現できることが示唆された。本研究内容はACS synthetic biologyにてAcceptされており、細菌における膜タンパク質分泌、シグナル伝達、膜分裂に関連する機能再現に資すると考えられる。

为了实现这一研究目标，我们创建了细菌大小的脂质体，其不同的蛋白质分布在脂质体膜的内部和外部小叶上。为了实现这一目标，我们重点研究了水包油乳化法和挤出机法的组合，这是过去报道过的脂质体生产方法。结果，苄基鸟嘌呤基团修饰的脂质和SNAP-GFP定向在脂质体膜的内层小叶中，并且生物素基团修饰的脂质和链霉亲和素-Alexaflure 647定向在外层小叶中。通过动态光散射评价所得脂质体的粒径分布，制备的脂质体的尺寸为直径1μm，证实制备了细菌大小的脂质体。此外，当使用流式细胞术评估 Alexaflure 647 和 SNAP-GFP 的荧光时，我们似乎成功构建了膜内外具有不同蛋白质组成的细菌大小的脂质体。由于所创建的脂质体是单层的对于再现细菌功能很重要，因此我们使用冷冻电子显微镜和α-溶血素评估了层状，很明显超过90%的脂质体是单层的。与过去已知的生产脂质体的方法挤出机方法相比，该结果非常高，并且表明使用该方法生产的脂质体可以高度再现细菌膜功能和结构。该研究已被ACS合成生物学所接受，有望为细菌中膜蛋白分泌、信号转导和膜裂变相关功能的再现做出贡献。

项目成果

A simple method for the creation of a bacteria-sized unilamellar liposome with different proteins localized to the respective sides of the membrane

一种创建细菌大小的单层脂质体的简单方法，该脂质体具有位于膜两侧的不同蛋白质

• 发表时间: 2023
• 期刊: ACS synthetic biology
• 影响因子: 4.7
• 作者: Kosaku Noba;Shogo Yoshimoto;Yoshikazu Tanaka;Takeshi Yokoyama;Tomoaki Matsuura;and Katsutoshi Hori
• 通讯作者: and Katsutoshi Hori