オートファジー欠損体を用いた植物体内の遊離亜鉛レベルを感知する新規センサーの探索

寻找一种新传感器，利用自噬缺陷细胞检测植物中的游离锌水平

• 批准号: 21J11995
• 负责人: 篠崎 大樹
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Meiji University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-28 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J11995/
• 关键词: オートファジー; 亜鉛; 鉄; 亜鉛欠乏耐性植物; 液胞内遊離亜鉛イオンセンサー; オートファジー; 亜鉛; 鉄; 亜鉛欠乏耐性植物; 液胞内遊離亜鉛イオンセンサー

本研究では、植物体内亜鉛利用効率が低下しているオートファジー欠損植物に対してゲノムにランダムな変異を導入する処理を行ったM2植物群から亜鉛欠乏耐性を得た個体を選抜している。これら耐性個体は、液胞内の遊離亜鉛イオン量の減少が感知されないことにより、亜鉛欠乏下でも過剰な鉄吸収が促進されておらず、亜鉛欠乏症状が発症していないと考えられる。このため、当該変異体について変異箇所を特定することで、新規液胞内遊離亜鉛イオンセンサーが同定できると期待できる。本年度（2022年度）は、前年度に選抜した7ラインの亜鉛欠乏耐性個体について次世代シーケンサーによる変異箇所の特定を行った。変異箇所の高精度な特定には，戻し交配を行い、無関係な変異の数を削減することが重要である。そこで、上記の7ラインについて、それぞれ戻し交配を行い、BC1F1種子を回収、これを自家受粉させてBC1F2種子を回収した。シーケンス解析用のゲノムDNAは、亜鉛欠乏条件で再選抜したBC1F2植物体各ライン60個体以上から調整した。このシーケンス解析の結果、4ライン分について候補遺伝子を擁立することができた。これらの候補について、遺伝子型を個体ごとに個別に確認することで、次世代シーケンス結果の妥当性を確認した。さらに、一部の候補遺伝子について、蛍光タンパク質を付加したコンストラクトを作成し、細胞内局在解析を進めた。また、さらに高精度に変異遺伝子を特定するために2回の戻し交配を経たBC2F2植物も用意した。これらについて、亜鉛欠乏条件での再選抜を実施し、5ライン分について次世代シーケンスに供するのに量的および質的に十分なサンプルを調整した。

在这项研究中，从经过治疗的M2植物中选择具有锌缺乏耐药性的个体，以将随机突变引入自噬缺陷植物的基因组，这些植物降低了植物的锌利用效率。这些抗性个体在液泡中的游离锌离子量中也没有被检测到，因此即使在锌缺乏量下也不会促进过度的铁吸收，也没有被认为没有锌缺乏症状。因此，可以预期，通过识别突变体的突变位置，可以鉴定出新的无腔内锌离子传感器。今年（2022年），我们使用下一代序列鉴定了上一年选择的七种锌缺乏式耐药性个体的突变位点。为了准确识别突变位点，进行反向交叉并减少无关突变的数量很重要。因此，对上面的七个线进行了反杂交，并收集了BC1F1种子，并自授予BC1F2种子以收集BC1F2种子。从在锌缺乏条件下重新选择的每条BC1F2植物的60个个体的60个个体中调整了用于测序的基因组DNA。由于此序列分析，建立了四个线的候选基因。对于这些候选者，对每个人进行了单独检查基因型，并确认了下一代测序结果的有效性。此外，创建了将荧光蛋白添加到某些候选基因中的构建体，并进行了亚细胞定位分析。此外，我们还准备了一个BC2F2植物，该工厂经历了两种反跨，以更准确地识别突变基因。这些是在锌缺乏条件下重新选择的，并在定量和定性上准备了5条线，以进行下一代测序。