基于结核分枝杆菌细胞壁生物合成通路的中药“狼毒”抗结核活性物质及其作用机制研究

Tuberculosis (TB) is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis. And, TB is faced with the grim situation of multidrug resistance TB and extensively drug-resistant TB. The enzymes existed in the biosynthetic pathway of M. tuberculosis cell wall (GlmU, MurA/MurB, RmlA/RmlB) are important novel targets of anti-tuberculosis drugs. Traditional Chinese medicine “Langdu” (known as Euphorbia fischeriana, Euphorbia ebracteolata) and the Chinese patent medicine “Jieheling” were used as the anti-tuberculosis agents traditionally. However, the bioactive substances of Euphorbia fischeriana and Euphorbia ebracteolata are ambiguous. In the previous study, the extracts of “Langdu” and the chemical constituents could inhibit the biosynthesis of the pathogen cell wall as well as the functions of GlmU and MurB, which showed significant inhibitory effects on M. tuberculosis. On the basis of high throughput screening system of M. tuberculosis and several target enzymes, the anti-tuberculosis substances of “Langdu” would be investigated using modern chromatographic and spectroscopic techniques. Meantime, on the basis of transcriptomics and proteomics, the influence of these target proteins on the metabolism of M. tuberculosis would also be investigated. Additionally, using chemical calculation, and group mutation, the reaction relationship between the active substances and the target proteins would be studied. Finally, the present program would expound the anti-tuberculosis substances of “Langdu” associated with multi targets of biosynthetic pathway of M. tuberculosis cell wall, which would be helpful for the novel anti-tuberculosis drugs development.

结核病是由结核分枝杆菌所引起的严重传染病，且耐药问题严峻，亟待发现新型抗结核药物。GlmU、MurA/MurB、RmlA/RmlB是细胞壁中肽聚糖及双糖链的关键合成酶，作为抗结核的新型作用靶点，有助于解决耐药问题。药用狼毒（狼毒大戟/月腺大戟）及其制剂-结核灵的抗结核药效确切，但活性物质与作用机制尚不明确。前期我们发现狼毒可明显影响结核杆菌细胞壁合成，显著抑制GlmU、MurB等靶蛋白的功能，表现出优良的抗结核作用。因此本项目基于结核杆菌细胞壁合成通路中多个关键靶点，采用化学生物学手段，揭示狼毒抗结核活性物质；基于上述系列靶蛋白，通过转录组/蛋白质组学方法，阐明活性物质对结核杆菌整体代谢网络的调控；运用分子-蛋白相互作用、点突变以及计算化学方法，阐明药效物质结构与靶蛋白的作用关系。基于结核杆菌细胞壁合成通路，系统揭示中药狼毒治疗结核的关键药效物质与作用规律，为新型抗结核药物的开发奠定基础。

中药狼毒具有散结、杀虫的功效，临床用于治疗结核病。本项目基于病原菌细胞壁合成通路中的关键靶点，阐明“狼毒”的抗结核活性物质及其作用机制。1.利用现代色谱、波谱技术从狼毒中分离鉴定140个化合物，揭示主要化学成分为二萜以及苯乙酮，为抗结核药效物质研究提供丰富的物质资源。2.17-羟基岩大戟内酯B（HJKB）能够显著抑制M. tb H37Ra的增殖，MIC为1.5 μg/mL，对临床毒性菌株以及多药耐药菌株也显示出极为高效的抑菌活性，是狼毒大戟抗结核主要活性物质。HJKB能进入巨噬细胞，有效杀灭病原菌，显示了在体抗结核的潜在作用。HJKB与利福平、乙胺丁醇均具有协同增效的联合作用模式。另外，以PPE19为代表的PE/PPE家族是HJKB发挥抗结核功效的潜在作用通路。3.本项目借助LC-MS/MS构建以13个二萜类化合物为指标成分的质控新方法。基于此方法，本项目成功对黑龙江、吉林等16个地区的狼毒药材进行二萜类成分含量测定，解析狼毒药材的地域特征。4.玫瑰烷型二萜YXL-19作为月腺大戟抗结核的主要活性物质，对M. tb H37Ra的MIC为6.25 μg/mL。通过分枝杆菌细胞壁合成酶多靶点的筛选，明确YXL-19显著抑制GlmU的乙酰基转移功能，IC50值为4.6 μg/mL，对底物AcCoA的抑制类型为竞争性抑制作用，Ki常数为18.5 μM。GlmU与YXL-19呈现浓度依赖性结合，动力学拟合的亲和力为KD 15.7 μM。PI染色以及扫描电镜均确认YXL-19对病原菌细胞壁的显著影响。5.本项目基于GDP-甘露糖作为糖基供体，阐述了蛋白质O-甘露糖基化在结核分枝杆菌增殖、细胞壁形成以及毒力中的重要作用；解析ManB催化GDP-甘露糖合成的酶促反应动力学。6.丝/苏氨酸蛋白激酶（STPK）催化的蛋白磷酸化参与病原菌细胞壁的合成、生长以及毒力等。本项目克隆10种丝/苏氨酸蛋白激酶，结合GlmU蛋白活性评价体系，成功构建STPK活性测定体系，为抗结核活性物质研究提供新技术。综上，本项目制备狼毒活性物质，阐明主要抗结核活性物质及其作用途径，探讨GlmU等蛋白参与细胞壁形成的生物活性，为抗结核活性物质研究提供物质资源、技术支撑，促进抗结核中药的科学开发。

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