PAAs类聚合物作为基因载体的构建策略的研究

Based on the AGM-CBA that has been built by our group, this project aims to investigate the structure-function correlation between functional groups and transfection efficiency of poly(amido amine)s (PAAs), by synthesizing PAAs with different amount of guanidinium group or disulfide bond or different alkyl chain lengths. We also intend to systematically investigate the key factors that may affect the transfection efficiency of polyplexe (polymer/DNA complexes) at the level of transcription and translation, in order to screen the key structure influencing the gene delivery capacity of polymers and provide systematic theory guidance and experimental evidence for further PAAs construction. Various experimental techniques, such as DLS、AFM、FCM、FM, will be used to study the physical and chemical properties, biological indicators, and transport mechanisms of polymers and polyplexes. Through these methods, we hope to find out the regularity between chemical structures and biological characteristics. “Fake plasmid participation” experiment will be designed to the key function of disulfie bond in the polymers. Laser scanning confocal microscope (LSCM) will be applied to confirm the nuclear localization ability of guanidinium group in the polymers. Finally, novel methods of CIDIQ (Confocal Image-assisted.3-Dimensionally Integrated Quantification) and FRAP (Fluorescence Recovery after Photo bleaching) will be used to discover the distribution of polylexe in the cell nucleus.

本项目以课题组前期构建的AGM-CBA作为基础载体，通过构建含有不同数量的胍基、二硫键和烷基侧链长度的PAAs（聚氨基胺类）类共聚物，旨在考察聚合物基因载体的功能基团与转染效率之间的构效关系，并在翻译和转录水平上对基因／载体复合物可能影响转染效率的环节进行系统考察，以期筛选出影响聚合物基因递送能力的关键结构，为进一步探索PAAs类基因载体的构建策略提供系统的理论指导和实验依据。利用多种技术（DLS、AFM、FCM、FM等）对构建的载体以及基因/载体复合物的理化性质、生物学指标、摄取和转运机制进行研究。应用“伪质粒参与”实验考察聚合物中二硫键的关键作用；以激光扫描共聚焦显微镜为主要方法，考察聚合物中胍基的核定位作用；应用CIDIQ（共聚焦成像偶联三维重构积分定量分析法）和FRAP（光漂白荧光恢复实验）两种手段，探索基因/载体复合物在细胞核内的分布。

在基因治疗领域中，非病毒类基因载体特别是阳离子聚合物因其较高的安全性和较易进行化学修饰的性质而越来越受到关注，但是存在着转染效率低、细胞毒性大和基因释放效率低等问题。本项目构建了七种含有不同功能基团，主链中含二硫键的新型生物可降解聚氨基胺类阳离子聚合物，对其化学结构以及包载pDNA后的物理化学性质和生物学性质进行了评价，考察了聚合物的不同功能基团与其作为基因载体的递送能力之间的关系。. 以课题组前期构建的AGM-CBA作为基础载体，加入不同的功能单体，包括γ-氨基丁酸（GABA）、组胺（HIS）、丁双胍（DAB-BG）、己双胍（DAH-BG）、4-（（8-（2-羟基苯甲酰胺基）辛酸）氨）乙胺（SNAC）、N-乙胺硫辛酰胺（DPA）和4-(1-氮杂环庚基)-1-丁胺（ABA）作为侧链，成功设计合成了一系列聚氨基胺类聚合物，用以调节载体的电荷密度、质子缓冲能力、细胞膜亲和力以及亲疏水性等。通过1H NMR、GPC以及MALDI-TOF-MS确证了产物结构，对聚合物包载pDNA的物理化学性质进行了考察，表明这些聚合物均具备将pDNA压缩为纳米复合物（粒径＜200nm）的能力，并具有一定抵抗负电性物质的能力、还原敏感性以及核酸酶稳定性。. 在生物学性质考察中，羧基、咪唑基以及疏水链的引入会进一步降低复合物的细胞毒性，可能与电荷密度的降低有关。双胍基与单胍基可以与细胞表面磷酸基团等形成二齿配位键；疏水链的引入使载体具有更高的亲脂性。这几种作用均能够提高载体的细胞膜的亲和力，使复合物细胞摄取显著增加。结合二硫键的基因释放能力以及胍基的核定位效应等因素，使新构建的聚合物载体转染效率大大提高。另外，双胍基类载体在体外表现出一定的抗肿瘤活性；疏水修饰的载体递送p53抑癌基因在体内外显示出优秀的抗肿瘤能力。这些特性证明该系列聚合物具有良好的基因载体应用潜力。. 本项目首次对聚合物基因载体的功能基团与转染效率之间的构效关系进行了考察，为进一步探索PAAs类基因载体的构建策略提供系统的理论指导和实验依据，达到了项目的预期研究目标。

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