水稻转运蛋白基因OsOPT5在雄蕊发育中的作用

雄性不育是杂交水稻得以成功利用的前提，也是植物生殖生物学研究的一个重要方面。水稻OsOPT5是我们最近从水稻中克隆的一个寡肽运输蛋白基因家族成员，但其运输的真正底物还未知。OsOPT5突变造成花粉败育、花丝伸长障碍、花药开裂受阻等表型。根据初步的研究结果推测OsOPT5可能影响某种代谢物或者矿质元素通过花丝导管向花药和花粉的运输，最终造成雄性不育。本项目将研究以下内容：(1)、通过将OsOPT5在异源缺陷型酵母中表达，和对前期研究发现的在突变体花丝导管中积累的一种未知的物质的鉴定,从而确定OsOPT5可能的运输底物是什么？(2)、 通过表达模式、组织的定位、以及转基因的超表达与降低表达,研究OsOPT5在水稻雄蕊发育中的生物学功能。最终回答关于OsOPT5的两个科学问题，即：(1) OsOPT5运输什么物质？(2) OsOPT5怎样影响水稻雄蕊发育和怎样影响花粉的正常发育？

植物OPT运输基因家族 ( oligopeptide transporter family , OPT )是一类较小的利用质子梯度产生的能量来介导底物运输的膜蛋白质家族。这一蛋白家族具有运输底物复杂性和基因功能多样性的特点。目前检测到的底物包括三类物质：（1）次级氨基酸与金属离子形成的复合物；（2）谷胱甘肽及其衍生物；（3）3 - 9个氨基酸组成的寡肽。功能分析表明这一蛋白家族在植物胚胎发育、逆境响应、金属离子运输、氮动员等多个生物学过程中发挥作用。.本项目对这一家族中的OsOPT5（后更名为OsOPT9）基因在水稻雄蕊发育过程中的生物学功能进行了详细的研究。OsOPT9位于水稻第八号染色体上。同源分析显示它属于水稻寡肽（OPT）运输家族PT亚家族，这一亚家族具有广泛的底物运输能力。已知的底物包括寡肽、金属离子及谷胱甘肽等小分子物质。OsOPT9突变体具有花粉败育引起的半雄性不育的特征。细胞生物学分析表明这种花粉败育是由于小孢子母细胞发育时期花药的绒毡层过早脱落降解造成的。而对突变体和OsOPT9的RNAi植株中的元素分析表明硼在突变体种子中的含量显著降低，而硼是花粉发育过程中非常重要的一种微量元素。分别用RT-PCR和GUS融合基因表达的方法对OsOPT9的表达进行了较为详细的分析发现：OsOPT9主要在花药等生殖器官表达，对不同发育阶段的幼穗进行了GUS染色分析发现OsOPT9基因活性随着小孢子的发育呈现弱到增加再到减弱的发展趋势，在单核花粉时期活性最强。通过RNAi干扰降低OsOPT9基因的表达会降低水稻花粉育性，从而降低结实率、单穗总粒数和千粒重；而超表达该基因则会提高结实率、单穗总粒数和千粒重。利用酵母互补实验测试了Pro-Leu、Thr-Leu、His-Ser、Glu-Lys、Gly-His-Gly这五种寡肽的转运，发现OsOPT9不具有转运这五种寡肽的能力。研究表明OsOPT9可能通过影响硼的运输导致花药绒毡层的提早解体从而影响花粉的育性，导致结实率、每穗总粒数及千粒重降低。

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