关于模拟细胞信号转导系统的新一代免疫生物传感器的研究

The aim of this study is to establish a next generation biosensor system that mimics the signaling strategy of living cells. The biosensors consist of giant liposome, which luminesce or fluoresce in the presence of ligands. This is achieved using modified receptor tyrosine kinases, such as epithelial growth factor receptors (EGFR), which dimerize upon ligand binding. Artificial receptors can also be synthesized by replacing the binding moieties of the receptors with antibody-fragments. The binding event is then transduced via the transmembrane domains into the vesicles, where enzyme fragments are reconstituted. This then results in the activation of the intra-vesicular substrates, yielding either a luminescence or fluorescence signal. In this configuration, the signal cascade closely resembles the natural biological signaling strategy employed by cells. Besides ligand detection, this study will also focus on tumor marker detection. Since the studied biosensor is a homogeneous assay, which does not need washing, it can provide a tool to visualizing small caner cells during a cancer surgery. This study will realize a next generation biosensor with ultra-high sensitivity.

本项目拟开展一项模拟细胞信号转导系统的人工细胞生物传感器的研究，该人工细胞在有检测目标时会发出荧光。在人工细胞的细胞膜上组装表皮生长因子受体，受体的胞内部分连接变异β-葡萄糖苷酸酶，变异的酶系没有活性的二聚体。当配体与受体结合时，其相互作用通过受体跨膜区转导至胞内β-葡萄糖苷酸酶，使之重新构建形成四聚体，恢复活性，分解底物产生荧光，使人工细胞发出荧光。进一步用肿瘤标志物抗体的可变区替代受体的配体结合区，当肿瘤标志物在人工细胞外部与抗体结合时，其相互作用亦传导至细胞内部使酶活性恢复，分解底物使人工细胞发出荧光。本传感器将实现简便迅速高感度的均相免疫检测，可用于肿瘤细胞成像研究，为手术中微小癌细胞的实时可视化提供一种工具。最后将人工细胞生物传感器应用于微流控芯片，实现配体及肿瘤标志物的单分子检测。本项目将完成一种超高感度的新一代免疫生物传感器的研究，为恶性肿瘤的早期诊断提供新技术与新方法。

本项目开展了一项基于开放式三明治免疫检测原理及酶片段互补分析的，模拟细胞信号转导原理的均相免疫检测技术研究。首先开展了基于开放式三明治免疫检测原理的抗体及检测技术的研究工作，通过噬菌体展示技术筛选了多个适用于本原理的单克隆抗体；将β-葡萄糖苷酸酶改造为没有活性的二聚体，分别连接抗体的重链可变区与轻链可变区，构建两个传感器元件，当他们与抗原结合时，β-葡萄糖苷酸酶重新构建成四聚体，恢复活性从而分解荧光底物产生荧光信号，实现了均相检测技术；将以上元件用于人工细胞，成功构建了新型免疫检测体系；实现了表皮生长因子受体等多个重要抗原及小分子物质的简便迅速超敏检测。本项目基于生物学、分析化学及生物医学工程等学科发展与综合交叉，完成一种迅速简便超敏的生物传感器的研究，实现了肿瘤标志物等的快速高敏检测，为细胞信号转导系统在生物学及临床医学等领域的应用提供重要的参考和依据，为物质检测及疾病的早期诊断提供了新方法、新技术，在检测技术及临床诊断技术研究上具有重要意义。

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