阴沟肠杆菌SDM中2,3-丁二醇手性形成及代谢调控机制研究

2,3-Butanediol and its derivatives are vital platform chemical. The three stereoisomers of 2,3-BD act as an excellent building block in asymmetric synthesis of highly valuable chiral compounds. Recently, the interest in microbial production of 2,3-BD and its optical stereoisomers has been increasing. Enterobacter cloacae SDM is an efficient biomass-utilizing producer of 2,3-Butanediol. It is the only microbe which can produce three stereoisomers of 2,3-BD. The genes for production of acetoin, the precursor for 2,3-BD, are in the alsRSD cluster. And the stereoisomers produced in microbe are depended on the type of the 2,3-butanediol dehydrogenase. In this work, the function of bdh and gdh will be identified by gene knockout and characterized of the enzyme. Meanwhile, the regulation of alsRDS gene cluster by AlsR will also be identified. And the regulation net work of acetate to 2,3-BD fermentation will be studied by transcriptome analysis. This work would reveal the regulation of the 2,3-butanediol production and the enzyme basis for the 2,3-BD stereoisomers produced in Enterobacter cloacae SDM。

2,3-丁二醇(BD)及其衍生物均为重要的平台化合物，同时BD的三种手性异构体在手性合成中具有重要用途。目前BD的生产主要依赖微生物发酵，其研究受到广泛关注。阴沟肠杆菌SDM底物谱广，可高效生产BD，是目前报道的唯一的一株可同时产3种BD异构体的菌株。分析表明该菌株中BD前体乙偶姻的合成关键基因位于操纵子alsRSD中，而不同手性异构体合成取决于胞内2,3-丁二醇脱氢酶（2,3-BDH）的类型。本研究拟从菌株SDM的全基因组分析入手，酶学性质分析和基因敲除相结合研究该菌株中2,3-BDH的生物学功能，确定其手性合成机制；通过基因敲除、凝胶阻滞等手段分析调控蛋白AlsR对alsRSD的表达调控机制；转录组学分析确定2,3-BD合成促进因子乙酸盐的调控网络；从而揭示其高效生产2,3-BD及不同手性异构体的具体产生机制，为基因工程改造获得高效手性BD工业菌株奠定基础。

阴沟肠杆菌SDM是一株生长迅速，底物谱广的菌株，具有很好的2,3-丁二醇发酵能力，但其所产2,3-丁二醇为混合物，为了发挥该菌株优势，本项目在前期研究基础上，通过外源表达、基因敲除、体外重组合成途径等手段，阐明了阴沟肠杆菌2,3-丁二醇手性合成机制；进一步通过基因敲除，qPCR等手段，揭示了乙酸盐可以通过上调alsR基因表达并进一步上调2,3-丁二醇合成途径中的budABC基因簇，促进2,3-丁二醇的合成，同时还发现乙酸盐可以通过调节胞内还原力还促进2,3-丁二醇的合成。在此基础上改造了阴沟肠杆菌2,3-丁二醇合成途径关键酶，得到的工程菌可以产手性纯(2R,3R)-丁二醇，产量达到152g/L，为目前报道最高产量；同时异源表达了(2S,3S)-丁二醇合成关键酶-乙酰乳酸合成酶和2,3-丁二醇脱羧酶，得到的工程菌以葡萄糖为底物直接转化可以产2.2 g/L (2S,3S)-丁二醇，是目前报道最高产量；敲除2,3-丁二醇脱氢酶的阴沟肠杆菌可以高产量的生产乙偶姻，经过NAD+再生体系改造和副产物途径改造，乙偶姻产量达到55.2 g/L；进一步的，我们还研究了地衣芽孢杆菌2,3-丁二醇手性合成机制，并改造地衣芽孢杆菌，生产手性2,3-丁二醇，(2R,3R)-丁二醇产量达到123.7 g/L，meso-2,3-丁二醇达到 90.1 g/L，纯度均大于99%。本研究结果对手性2,3-丁二醇生产具有重要的指导意义，得到的工程菌株具有较高的工业应用价值。

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