安莎的新骨架发掘与药用功能导向的结构优化

The ansamycin family contains several well-known drug leads, such as anti-tuberculous rifamycins, antitumor maytansinoids and geldanamycins, indicating its high degree of druggability. Ansamycins belong to macrolactams that are synthesized by type I polyketide synthase (PKS). Compared with macrolides which are also synthesized by type I PKS, ansamycins are of lower diversity in structural types, indicating the potentiality of discovering more novel skeletons of this family. However, ansamycins have high diversity in extender units and post-PKS modifications, which has great influence on their bioactivities and provides opportunities for structure optimizations..In this project, we aim to novel skeleton panning, function-orientated biosynthesis and targeted-production of ansamycins. Specifically, through interdisciplinary and integrated approaches of genetics, medicinal chemistry of natural products and structural biology, we are going to obtain drug leads with R&D potential by thoroughly exploiting novel ansamycins of nonaketide. By targeting the mechanism of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis, we will carry out the design and biosynthesis of novel backbone rifamycin derivatives through engineering the types and numbers of extender units so as to find new anti-tuberculous drugs. We will try to attain high yield production of 3-O-L-alanyl maytansinol, the critical intermediate of antitumor antibody-maytansinoid conjugates by protein engineering and gene mining of alanylase in parallel, and systematically manipulating Actinosynnema pretiosum ATCC31565Dasm19 to increase the yield of maytansinol. This project is significant in exploring new approaches to drug discovery from natural products and drug innovation.

安莎家族有多个著名药物先导，如抗结核利福霉素、抗肿瘤美登木素和格尔德霉素，其药用潜力值得发掘。安莎属于I型聚酮大环内酰胺，与I型聚酮大环内酯的结构类型丰富多样相比，自然界还可能存在多种安莎新骨架；此外，安莎的聚酮延伸单元和后修饰丰富多样，对其生物活性有显著影响。本申请项目拟开展安莎的新骨架发掘与合成和定向制造研究，包括：运用遗传学、天然药物化学和结构生物学等交叉的综合性研究手段，深度挖掘11酮新骨架安莎，获得有开发潜力的药物先导；针对结核分枝杆菌耐利福平的分子机制，通过改造延伸单元的类型和数目，合成新骨架“利福霉素”，以期发现抗耐药结核病新药；平行开展丙氨酰化酶的改造和基因挖掘研究，并系统地遗传改造橙色珍贵束丝放线菌ATCC31565Dasm19菌株，提高美登醇的产量，力图实现美登木素抗体偶联物的重要中间体—L-丙氨酰美登醇的高效合成，对探索天然药物发现与创新的新途径有重要意义。

本项目研究主要开展了美登木素和利福霉素的合成生物学结构优化。.使用生物信息学方法挖掘得到7个具有不同排列方式的细菌美登木素基因簇，并重构了其可能的祖先基因簇和进化过程；发现Amycolatopsis alba DSM 44262菌株的asc基因簇具有独特的基因排列方式；以asc基因簇为对象，研究了细菌美登木素生物合成的后修饰途径；通过基因失活和异源表达实验，得到了系列美登木素衍生物，包括7个新化合物，其中两个显示良好的抗肿瘤活性，有潜力成为美登木素ADC的先导化合物；通过异源表达，发现AstC可以在体内催化美登醇C-3位羟基的丙氨酰化，并得到一个具有良好抗肿瘤活性的新化合物，提示AstC可以用于丙氨酰美登醇的合成。本项目研究成果不仅为解决美登木素来源的问题提供了新的思路，而且发现了这类天然产物的新型构效关系，为美登木素类药物的研发提供了潜在先导化合物和理论基础，对探索天然药物发现与创新的新途径有重要意义。.本项目主要从三方面开展利福霉素的合成生物学结构优化，以丰富利福霉素的结构多样性，获得可供活性筛选的利福霉素衍生物。首先对利福霉素高产菌株A. mediterranei S699进行YMG琼脂平板发酵，得到11个化合物，包括6个新化合物。其中，利福霉素糖苷1和2的聚酮骨架代表利福霉素安莎链的一种新颖断裂方式。化合物6和8显示出潜在的鼠伤寒沙门菌III型分泌系统抑制活性，可用于抗革兰阴性菌感染药物的开发。此外，化合物6还能够诱导人结肠癌HCT116细胞的G2/M期阻滞和细胞损伤。其次对利福霉素聚酮链延伸单元和延伸数目进行改造，期望合成具有较长支链或者缩环的利福霉素衍生物。通过一系列模块融合以及点突变实验，证明了聚酮延伸过程中保留KS-AT linker的重要性和以KR-ACP linker进行模块融合的可行性，从而进一步加深了对于安莎聚酮结构改造的认识。还对利福霉素生物合成中特殊的后修饰过程进行了探索，包括proansamycin X到rifamycin W形成过程中的分支路径，Rif-orf5催化的rifamycin W骨架重排机制，Rif-orf19催化的萘环形成机制，以及异位表达异源氨甲酰基转移酶基因获得新颖氨甲酰化利福霉素衍生物。

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