免疫调控PD-1/PD-L1信号通路的小分子发现及抗肿瘤活性研究

PD-1 is a key factor in the tumor immune escape. Exploration and discovery of anti-tumor small-molecule drugs via target-regulating the expression of PD-1 gene is a new approach to antitumor drug research.In the project,based on the method of computer-aided drug design, we select the G-rich sequences of PD-1 gene to construct the G-quadruplex (also called G4) used as targets and carry out the screening, optimization and design of small molecule structures. Then through a series of multidisciplinary experimental techniques such as chemical biology, we investigate the ability of fused heterocyclic compounds and cyclic polyamides to induce the formation of and stabilize the G4 structures in the G-rich sequence of PD-1 gene promoter region , consequently downregulate the PD-1 expression and block or suppress the PD-1/PD-L1 signaling passway in tumor cells, activate the T cell immune functions, finally inhibit activity of the tumor cells. It is expected in the research that we can discover several leading compounds which may immunoregulate PD-1/PD-L1 passway, then inhibit proliferation and/or promote the apoptosis of the tumor cells by a novel antitumor research approach and ascertain the ineraction mechanism via small molecules target-regulating PD-1 gene. This study is of importance for the development of small molecular immune drugs.

PD-1是肿瘤免疫逃匿的关键因子，利用小分子调控PD-1基因的表达，探索与发现靶向PD-1基因的小分子抗肿瘤药物是一种全新的抗肿瘤药物研究途径。本项目以计算机模拟及辅助药物设计手段为基础，以PD-1基因富G序列为靶标，构建其G-四链体（G4）结构，进行基于G4结构的靶向PD-1基因的小分子结构设计、筛选与优化；通过一系列化学生物学等多学科实验技术，从细胞外分子水平到细胞内、最终利用鼠模型，探索稠杂环和环状聚酰胺分子诱导PD-1基因富G序列形成和稳定G4结构，从而下调PD-1基因的表达，阻断或抑制肿瘤细胞PD-1/PD-L1信号通路，激活T细胞免疫功能，抑制肿瘤细胞活性等系列问题。研究有望探索出一条新的靶向PD-1基因的小分子抗肿瘤途径和机制，对小分子免疫治疗药物研发意义重大。研究目标：发现几种免疫调节PD-1/PD-L1通路，从而抑制肿瘤细胞增殖和促进其凋亡的小分子先导化合物及探明机制。

（i）项目组按申报书中的研究内容首先对苯并杂蒽类、吡咯-咪唑聚酰胺、4,5-二氮芴类、1，8-萘酰亚胺衍生物及苯并香豆素类化合物进行了靶向PD-L1/PD-1轴抑制剂进行了设计、合成和优化筛选。完成了几类候选化合物制备工艺路线优化。.（ii）首先考察了聚酰胺与PD-L1基因的作用能力。结果表明：筛选出的聚酰胺1和2能特异性地与28nt PD-L1基因启动子核心DNA序列在Stat3蛋白存在的条件下，产生较强的竞争性作用，且是浓度依赖性的。并且，通过圆二色谱（CD）、表面等离子共振技术（SPR）、分子对接研究（docking）和熔融温度分析（Tm）等实验也证实了这一结果。然后，证明了聚酰胺在Jurkat T细胞存在/缺少条件下，对HCC827和MDA-MB-231肿瘤细胞具有抗增殖和促凋亡效果，并呈浓度依赖性。说明聚酰胺通过免疫和非免疫通路达到抗肿瘤目的。另外，通过均相时间分辨荧光实验（HTRF）对联苯-嘧啶结构、联苯-1,2,3-三唑-苯腈衍生物抑制PD-1/PD-L1的相互作用，从而恢复T细胞的活性达到抗肿瘤效果的探究，这类化合物值得进一步优化。我们完成了对苯并噻唑并萘酰亚胺衍生物靶向线粒体G-四链体抗肝癌效果的体内外研究，发现一种化合物7c/8c (7c的盐)具有较好的抗肝癌效果（细胞的IC50值为0.59±0.08 µM；肿瘤抑制率：51.4%），是具有潜力的先导化合物；靶向PD-1 G-四链体的研究也在进行中。其它结构化合物靶向PD-L1/PD-1作用抗肿瘤活性研究也正在进行中，成果将进一步发表中。以上这些研究对发现靶向G-四链体PD-1/PD-L1轴抗肿瘤候选药物具有重要价值。.（iii）初步研究发现苯并硒杂蒽衍生物能够靶向PD-1 G-四链体，进一步的体内外试验正在进行中，成果将近期发表。.（iv）公开发表了SCI研究论文13 篇，其中Top 论文5篇；申请专利5件，其中授权2件；培养3名本科生、2名硕士生、2名博士生和2名博士后；在专业学会上发表研究成果5次。基本达到项目的预期目标和要求。.

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