隐丹参酮靶向蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2抑制动脉粥样硬化斑块内微血管新生的机制研究

Atherosclerotic plaque neovascularization is one of the key factors for the development of atherosclerosis (AS) and the formation of unstable plaques. Inhibition of plaque neovascularization is a scientific problem to be solved urgently at present. ①In our previous study, we found that cryptotanshinone significantly inhibit angiogenesis in vitro. ②It is reported that cryptotanshinone could inhibit the activity of the protein tyrosine phosphatase SHP-2 by combination with its PTP domain. ③We found that silencing expression of SHP-2 by shRNA significantly decreased angiogenesis in vitro. ④Moreover, in the endothelial-specific inducible SHP2 knockout mice, we found that SHP-2 knockout decrease neovascularization in the retina. These results suggest that cryptotanshinone might inhibit angiogenesis through SHP-2. Therefore, we will investigate the effect of cryptotanshinone in ApoE-/- AS model or ApoE-/-mice induced with endothelial-specific knockout of SHP-2 on the progress of AS and plaque neovascularization. In vitro, we will promote SHP-2 expression and inhibit or silence SHP-2 expression to further clarify the effects of cryptotanshinone on angiogenesis and signal pathway. The results will provide a theoretical basis for the prevention and treatment of AS.

斑块内新生微血管是动脉粥样硬化（AS）进展及不稳定斑块形成的关键因素，抑制斑块内微血管新生是目前亟待解决的科学问题。①我们前期发现丹参单体隐丹参酮能显著抑制体外血管新生，②文献报道隐丹参酮能与蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2结合抑制其活性，③我们发现ShRNA沉默SHP-2表达后内皮细胞血管新生明显减少，④我们在可诱导内皮敲除SHP-2的小鼠模型（SHP-2IECKO）中发现SHP-2诱导敲除后视网膜中新生血管末端数量显著减少，提示隐丹参酮可能通过抑制SHP-2进而抑制血管新生。为此，我们拟采用ApoE-/-和SHP-2IECKO/ApoE-/-小鼠建立AS模型，前者给予隐丹参酮干预，分析药物抑制和基因缺失分别对AS进展及斑块内微血管新生的影响；在体外运用SHP-2过表达、抑制和基因沉默等方法，进一步明确隐丹参酮及其靶点SHP-2在内皮细胞血管新生中的作用，为其对AS的防治提供新的理论依据。

一直以来认为隐丹参酮是一种天然的SHP2抑制剂，其主要是通过与SHP2催化位点结合发挥作用。在我们的研究中，通过隐丹参酮干预ApoE-/-小鼠后，可缓解动脉粥样硬化，主要表现为斑块内巨噬细胞减少。在机制上进行探究发现，隐丹参酮可抑制VEGFR2信号通路进而抑制血管新生，SHP2抑制剂也可抑制血管新生以及内皮细胞迁移侵袭能力。我们选用SHP2别构抑制剂SHP099分别对ApoE-/-和LDLR-/-小鼠模型进行干预发现，SHP2抑制可导致主动脉斑块增多，这与国内外报道截然相反。进一步对斑块分析发现，SHP2的抑制可导致斑块内胶原成分减少、坏死核面积增大、凋亡小体以及巨噬细胞含量增多。这些表现均提示我们SHP2抑制可使动脉粥样硬化斑块处于不稳定进展期。SHP2缺失可抑制血管新生，但在体SHP2抑制剂干预后却促进动脉粥样硬化。为了进一步探究这一现象的原因，我们对小鼠主动脉组织进行流式分析发现，SHP099使巨噬细胞在免疫细胞中的占比增多。因此我们猜测在斑块内SHP2对巨噬细胞的调控作用更为强烈。为了验证我们的猜想，构建了巨噬细胞特异性敲除的模型，即LySM-cre SHP2f/f ApoE-/-小鼠模型。巨噬细胞中SHP2的缺失可促使小鼠主动脉斑块增多，且斑块内巨噬细胞的含量增加。在体外探究SHP2对巨噬细胞功能的调控发现，SHP2的缺失可造成巨噬细胞向M1促炎型分化，且脂质吞噬及胞葬功能受损。因此我们认为SHP2缺失后主要通过使巨噬细胞功能失调进而促进动脉粥样硬化发展。在分子机制上，我们通过RNA-seq的差异基因预测了可能调控的转录因子，由此关注了其中的过氧化物酶体PPARγ。通过PPARγ激动剂罗格列酮干预，可在细胞水平上恢复由SHP2缺失造成的巨噬细胞功能失调。为了验证隐丹参酮对巨噬细胞调控作用是否与SHP2一致，我们也在体外探究了隐丹参酮对巨噬细胞极化的调控作用，结果显示隐丹参酮可抑制M1促炎型巨噬细胞分化，进一步研究仍在进行，初步认为SHP2并不是隐丹参酮的靶点。 .综上，我们一方面阐明了隐丹参酮可抑制VEGFR2信号通路进而抑制血管新生，SHP2并非隐丹参酮作用靶点。隐丹参酮也可抑制 M1 促炎型巨噬细胞活化。另一方面证实SHP2是一个抗动脉粥样硬化分子，可增强巨噬细胞胞葬功能及促进M2抑炎型巨噬细胞活化。

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