TALEN介导的SMN1基因原位修复研究

Spinal muscular atrophy (SMA), which is a common neuromuscular disorder with autosomal recessive inheritance, resulting in the degeneration of motor neurons, is caused by homozygous deletion, truncation, mutation or gene conversion of survival motor neuron 1(SMN1). Then approximately 98.7% in patients is the deletion of the SMN1 gene in exon 7 or even in exon 7 and exon 8. SMA is the first substantial genetic diseases of infant death. The estimated incidence is 1 in 6000～10,000 newborns with a carrier frequency of 1 in 40～60. At present, SMA no effective treatment. Gene therapy has brought about a new way therapy for severe monogenic disease similar to SMA. It is not an ideal approach that through add SMN1 gene or using SMN2 instead of SMN1. We highlight in situ remediation strategies for SMN1 gene, in situ added the SMN1 gene in exon 7, 8 by gene targeting. Combine with, we had established, iPSC technology, stem cell gene targeting technology and TALEN technology, we hope to establish an effective therapy for SMA.

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是一种常染色体隐性遗传病，是由于SMN1基因的纯合性缺失、突变以及截断，导致脊髓前角运动神经元退行性病变。据统计，大约有98.7%的SMA患者是SMN1基因的7号外显子缺失甚至7、8号外显子同时缺失，同时SMA也是导致婴幼儿死亡的第一大遗传性疾病。其发病率为1/6000～1/10000，携带率为1/40～1/50。目前，SMA无有效的治疗方法。基因治疗为类似SMA这样的严重单基因遗传病带来了新的治疗方式，但常规的添加SMN1基因或利用SMN2替代SMN1的基因治疗方法并不理想。由此我们提出一种针对SMN1基因的原位修复策略，即通过基因打靶将SMN1基因中缺失的7、8号外显子原位添加进去。联合我们已建立的iPSC技术、干细胞基因打靶技术以及TALEN技术，我们希望能够为SMA提供有效的基因治疗方案。

脊髓性肌萎缩症(SMA)主要是由运动神经元生存基因1(SMN1)的纯合缺失造成SMN蛋白表达减少，引起的神经退行性疾病。SMA的主要临床特征是由于运动神经元功能障碍和丧失导致渐进性肌肉无力和萎缩。间充质干细胞（MSCs）已被报道在SMA的小鼠模型中可以改善运动神经元的生存和运动功能。但体外培养MSCs时，增殖能力下降的问题限制了其在临床上的应用。在本研究中，我们使用核糖体基因（rDNA）区靶向载体和类转录激活因子样效应物切口酶（TALENickases）高效地将SMN1靶入到SMA患者特异性诱导多潜能干细胞(SMA-iPSCs)的rDNA区；然后将SMN1定点整合的SMA-iPSCs（SMN1-iPSCs）分化为MSCs（SMN1-MSCs），并检测SMN1的表达情况。为MSCs细胞治疗SMA提供一种新的思路。. 主要研究内容：（1）收集SMA患者的尿液细胞，分离培养并使用携带四种转录因子的逆转录病毒将其诱导为SMA-iPSCs；（2）利用TALENickases将外源SMN1靶入SMA-iPSCs的rDNA区；（3）将SMN1-iPSCs定向分化为SMN1-MSCs；（4）利用实时荧光定量PCR（qPCR）、Western Blot和免疫荧光染色检测SMN1-MSCs中SMN1的表达。. 结果：（1）成功诱导了一株SMA病人iPSCs，其具有正常胚胎干细胞相同的特性，能够表达干细胞表面标志物以及在体内分化为三个胚层的能力；（2）通过PCR和Southern Blot鉴定出SMN1-iPSCs；（3）通过表面标志物和分化潜能检测证明SMN1-MSCs具有与人骨髓来源的MSCs相似的干细胞特性；（4）通过qPCR 和Western Blot检测显示，SMN1-MSCs中SMN1转录表达水平是SMA-MSCs的3.86倍，SMN1-MSCs中SMN蛋白表达水平为SMA-MSCs的2.1倍；同时免疫荧光染色显示，SMN1-MSCs和h-MSCs的细胞核内能够观察到SMN蛋白复合物多聚体结构，而SMA-MSCs细胞核内则未观察到该结构。. 结论：（1）首次将外源SMN1定点整合至SMA-iPSCs中；（2）定点整合进核糖体基因区的外源SMN1能够有效表达，并且将定点整合iPSCs分化为MSCs后，仍然能够将SMN蛋白的表达恢复至正常水平。

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