TMEM74关联信号介导的神经元自噬稳态失衡参与焦虑障碍的分子机制研究

Anxiety disorders are common in modern information society. The pathogenesis of anxiety disorders is not yet clear and treatments are limited. In our previous study, we found that TMEM74 knockout (Tmem74-/-) mice will present obvious anxiety- not depression-like behavior, but no report focused on the mechanism of anxiety-like behavior with TMEM74. In this study, we primarily demonstrate the TMEM74 distribution in rodent brain. Subsequently, combined approach using electrophysiological and patch-clamp technique are used to investigate the effect of TMEM74 knockout on the function of central nervous system including specific regional neuronal morphology, synaptic number and anxiety-related neural circuit. Third, we focus on the role of TMEM74 intracellular signaling between autophagy and the pathological process of anxiety. In addition, we also determine TMEM74 level in anxiety animal model and anxiety patients and verify whether anti-anxiety drugs intervention or lentiviral overexpression of TMEM74 can reverse Tmem74-/- induced anxiety-like behaviors in rodent. Consequently, the present project will lay a foundation for TMEM74 as a therapeutic target for anxiety disorders and developing novel anti-anxiety agents.

焦虑障碍很普遍，但确切病理机制未明而治疗方法和疗效有限。我们前期的行为学观察发现，TMEM74敲除小鼠会呈现明显焦虑而非抑郁样表现，但尚未见TMEM74参与焦虑病理机制方面的报道。本项目我们将继续以TMEM74为切入点，在确定TMEM74小鼠脑内的空间分布、神经元表达类型及亚细胞定位的基础上，利用电生理、免疫印迹、免疫荧光等技术，考察TMEM74基因敲除对小鼠特定脑区神经元形态、突触数量及焦虑关联神经信号环路功能的影响，重点关注自噬异常相关通路参与TMEM74信号紊乱引发焦虑样表现的分子机制，并对经典焦虑动物模型和患者进行TMMEM74水平检测，同时验证抗焦虑药物或慢病毒过表达TMEM74是否可逆转TMEM74敲除小鼠的焦虑样表现及关联神经生化指标。本项目的实施旨在揭示TMEM74 关联信号异常在焦虑病理过程中的作用机制，为研发新靶点抗焦虑药物奠定基础，具有重要科学意义和潜在临床价值。

研究背景：焦虑障碍是当今最常见的一类精神障碍，给个人及社会带来了极大的精神压力和经济负担，其病理过程关联的分子机制研究有待深入阐明。TMEMs（Transmembrane protein）是一类跨膜蛋白，近年来已报道多个TMEM蛋白在惊恐障碍、焦虑障碍等神经精神疾病中发挥重要作用。基于TMEM74在成年人的脑内高度聚集，推测对神经系统功能具有一定作用。.研究内容与重要结果：一、研究在动物水平通过基因敲除技术构建TMEM74整体和部位选择性敲除小鼠模型，采用多种行为学方法进行焦虑等多方面行为学指标检测。结果发现两类TMEM74敲除小鼠可诱发焦虑表型，初步认为TMEM74引起的信号紊乱会引发与焦虑有关。二、进一步锁定TMEM74富集的BLA区锥体神经元，采用离体电生理技术来检测其神经元特性变化，结果发现TMEM74 敲除后锥体神经元动作电位发放呈电流依赖性增加，c-Fos阳性的锥体神经元数量均显著增加，提示该脑区神经元兴奋性增加。研究并未发现对 TMEM74 敲除小鼠脑内自噬相关蛋白表达的显著变化，而发现了HCN离子通道功能的损伤。三、对慢性束缚应激焦虑模型小鼠的取样检测发现,经典焦虑模型小鼠BLA脑区TMEM74的蛋白表达量显著降低。对野生型小鼠BLA脑区脑定位注射AAV病毒以特异性过表达TMEM74蛋白，可有效抑制CIS小鼠BLA脑区TMEM74蛋白表达的降低，逆转CIS小鼠的焦虑样表型。对临床焦虑障碍患者的分析也提示焦虑患者外周血的TMEM74降低，而治疗可部分逆转。.结论及科学意义：研究首次发现TMEM74在焦虑患者及焦虑小鼠体内蛋白表达量降低，过表达Tmem74能够治疗小鼠的焦虑表型。通过增加BLA区锥体神经元兴奋性可以实现对焦虑行为的调控。Tmem74直接调节HCN通道而非自噬来增强BLA区锥体神经元兴奋性来介导焦虑行为。重新表达Tmem74能够有效修复损伤的神经元功能，逆转Tmem74基因敲除小鼠焦虑表型。因此，Tmem74是焦虑障碍诊断、症状监测的潜在生物学标记物和抗焦虑治疗的潜在药物靶标。

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