慢性乙醇暴露引起神经细胞凋亡NMDA受体机制的研究

采用不同浓度乙醇替代饮水建立小鼠慢性乙醇暴露动物模型，应用RT-PCR、TUNEL、蛋白印迹、免疫组化、电镜、激光共聚焦显微镜、细胞内游离钙离子测定等技术，研究慢性乙醇暴露引起的脑神经细胞凋亡与NMDA、IP3受体、SERCA1、细胞内[Ca2+]i变化和caspase-3、Bax和Bcl-2表达的关系，NMDA受体拮抗剂美金刚和caspase-3特异性抑制剂zDEVD-fmk对神经细胞的保护作用；应用乙醇对小鼠胚胎原代脑皮质神经细胞和H4人脑胶质瘤细胞株培养细胞进行处理，并应用上述实验技术研究在siRNA干扰NMDA、IP3受体和SERCA1基因和美金刚、zDEVD-fmk抑制剂作用下慢性乙醇暴露引起的培养神经细胞凋亡与NMDA受体、细胞内[Ca2+]i及caspase-3等相关蛋白因子变化的关系，研究慢性乙醇暴露引起神经细胞凋亡的NMDA受体机制及美金刚的保护作用。

长期过度饮酒可引起慢性乙醇中毒，并可导致以记忆障碍、智能降低为主要表现的酒精性痴呆，约占慢性乙醇中毒的10%。慢性乙醇中毒可引起神经细胞变性、凋亡、细胞缺失，但机制不清。现认为与乙醇的直接神经毒性作用有关。细胞内[Ca2+]i的增加，将引起神经细胞的凋亡。NMDAR（NR1）是重要的配体门控Ca2+通道，与学习、记忆有密切关系。美金刚是NMDA受体的非竞争性拮抗剂。.本项目应用流式细胞、RNAi基因沉默、qPCR、Western Blot、TUNEL、免疫组化、免疫荧光、细胞内[Ca2+]i测定等技术，研究不同浓度乙醇作用引起的实验动物和SK-N-SH、H4细胞株细胞的凋亡、细胞存活率、NMDA受体、IP3受体、SERCA1、细胞内[Ca2+]i和caspase-3的变化，以及美金刚的保护作用，探讨乙醇暴露引起神经细胞凋亡的NMDA受体机制。.结果发现：（1）乙醇暴露诱导SK-N-SH细胞凋亡，并诱导NR1表达增强和细胞内[Ca2+]i增高，其变化的程度与乙醇暴露的时间和浓度具有相关性。（2）美金刚、siRNA下调NR1基因抑制了乙醇暴露诱导的SK-N-SH细胞NR1、caspase-3蛋白表达增强，同时抑制了细胞内[Ca2+]i浓度的增高，并对细胞凋亡具有抑制作用。（3）乙醇暴露诱导H4细胞凋亡，并诱导NMDAR（NR1）、IP3R、SERCA1表达增强和细胞内[Ca2+]i增高。（4）经qPCR检测，乙醇暴露诱导H4细胞NR1、IP3R、SERCA1表达增强的同时，也同时诱导其mRNA表达增强。（5）美金刚抑制乙醇引起的H4细胞NR1表达增强和细胞内[Ca2+]i增高，抑制细胞凋亡。（6）乙醇暴露诱导H4细胞caspase-3活化，美金刚则使活化的caspase-3量降低；低钙培养液减弱了乙醇诱导的caspase-3的活化。（7）慢性乙醇暴露引起小鼠神经细胞凋亡，同时引起神经细胞NSE表达降低、caspase-3表达增加。（8）慢性乙醇暴露引起小鼠神经细胞NR1、IP3R1表达增强。.结果表明，慢性乙醇暴露引起的神经细胞凋亡与乙醇诱导的NMDA受体表达增强，进而引起的细胞内[Ca2+]i增高有关；美金刚对慢性乙醇中毒引起的神经细胞的凋亡具有抑制作用。本项研究对酒精中毒性痴呆的防治具有重要的医学价值。

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