纳米尺度聚乙烯亚胺载体特性对固定化k.fragilis β-半乳糖苷酶催化活性及稳定性的影响机制

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项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号:
    31772019
  • 项目类别:
    面上项目
  • 资助金额:
    60.0万
  • 负责人:
  • 依托单位:
  • 学科分类:
    C2001.食品原料学
  • 结题年份:
    2021
  • 批准年份:
    2017
  • 项目状态:
    已结题
  • 起止时间:
    2018-01-01 至2021-12-31

项目摘要

Galacto-oligosaccharide (GOS) has been considered as promising prebiotic compound produced by hydrolysis of lactose using β-galactosidase. The activity and stability of the immobilized enzymes is of fundamental importance for the synthesis performance of GOS. Spherical polyelectrolytes that consist of a nano-sized solid core onto which chains of a polyethylenimine are attached have been prepared as carrier of enzymes immobilization under the financial support of national 863 project. The carrier properties significantly impact the activity and stability of immobilized enzyme, but its mechanism remains unclear. The effect of spherical polyelectrolytes properties (PEI graft density, chain length and charge density) on K.fragilis β-galactosidase adsorption, desorption and distribution of adsorbed enzyme within PEI is investigated using small-angle X-ray scattering (SAXS), as well as quartz crystal microbalance for in situ and real-time measurements. The secondary structure change of adsorbed enzyme induced by carrier properties is determined by attenuated total reflection Flourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy. Isothermal titration calorimetry (ITC) is used to determine the enthalpy,entropy, binding constant K and the number of binding sites (N). Adsorption kinetics and catalytic kinetics is studied in batch system. The mechanism for the effect of carrier properties on adsorbed enzyme activity and stability will be completely elucidated, this will promote to develop efficient spherical polyelectrolytes for enzyme immobilization and improve catalysis efficiency of GOS.
低聚半乳糖(GOS)是促进人体营养与健康的益生元,固定化酶活性与稳定性对酶法合成GOS效率有重要影响。前期在国家“863”计划资助下创制了纳米粒子表面接枝聚乙烯亚胺的吸附型固定化酶载体,载体特性显著影响固定化酶活性与稳定性,但影响机制尚不清楚。针对这一科学问题,使用石英晶体微天平、小角X-射线散射技术研究载体特性(载体表面锚定的聚乙烯亚胺密度、链长、电荷密度)对k.fragilis β-半乳糖苷酶吸附、解吸及酶分布规律的影响,应用衰减-全反射傅里叶变换红外光谱技术解析载体特性诱导固定化k.fragilis β-半乳糖苷酶的结构变化规律,采用等温滴定量热技术分析载体特性对酶吸附过程熵变、焓变、结合常数等热力学性质的影响,探讨载体特性对酶吸附动力学及酶催化动力学的影响。揭示聚离子载体特性影响固定化酶催化活性、稳定性的机制,为设计高效的聚离子酶固定化载体、提高酶法合成低聚半乳糖效率提供基础。

结项摘要

聚离子载体表面锚定的聚离子链长、密度影响吸附酶的催化活性与稳定性,但机制尚不清楚。为阐明该机制,本项目合成了6种纳米尺度聚乙烯亚胺(PEI)球形载体(表面锚定的聚离子链长、密度不同),应用耗散型石英晶体微天平(QCM-D)、圆二色谱(CD)研究了载体特性(PEI链长、密度)对k.fragilis β-半乳糖苷酶的吸附能力,及对酶分子二级结构变化的影响,等温滴定量热(ITC)分析了载体特性对酶吸附过程熵变、焓变、结合常数等热力学参数变化的影响;研究了聚离子载体固定化k.fragilis β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的操作稳定性。 结果表明本项目合成的聚乙烯亚胺载体大小均一、单分散、粒径为200-400 nm的微球,比表面积550-600 m2/g载体,孔径8-10 nm。QCM-D 研究表明QCM-D石英晶体表面锚定聚乙烯亚胺(PEI)的分子量700、2500、7500 Mw时,PEI对K. fragilis β-半乳糖苷酶的饱和吸附量分别为220.35 ng/cm2、324.16 ng/cm2、440.76 ng/cm2,pH、离子强度影响QCM-D对酶的吸附。实验测定结果表明聚离子载体表面锚定的PEI链长(分子量)、密度显著影响酶的吸附量与稳定性,PEI分子量从700,2500增加至7500 Mw,吸附的k.fragilis β-半乳糖苷酶从81.3、114.5增加至127.3mg/g载体,PEI的密度为34.17 mmol/L, 11.25mmol/L时,其吸附的k.fragilis β-半乳糖苷酶的耐热性比自由酶分别增加2.1倍、1.6倍。pH诱导k.fragilis β-半乳糖苷酶二级结构中的β-折叠向α-螺旋转变引起酶失活,载体表面锚定的PEI密度影响吸附酶二级结构中的α-螺旋、β-折叠的稳定性,因而影响吸附酶的稳定性。ITC的热动力学参数表明pEI 吸附k.fragilis β-半乳糖苷酶是自发的吸热过程,PEI 的密度影响载体与酶吸附过程的结合力。聚离子载体表面锚定的PEI密度显著影响吸附k.fragilis β-半乳糖苷酶的操作稳定性,聚离子载体吸附酶(PEI密度35.47mmol/cm2)在搅拌型反应器重复使用10次后酶活性保留82.9%,在填充床反应器连续使用15天酶活性保留80.6%。综上,聚离子载体特性(PEI链长、密度)影响酶的吸附量、

项目成果

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课题项目:调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要:

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题,其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子,其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而,TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用,影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法,探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用,为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义,并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路:

科学问题:TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达?
前期研究:已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应,但其具体机制尚不明确。
研究创新点:本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线:包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术:TRIM2与病毒RNA的相互作用分析,IFN-β启动子活性检测。
实验模型:使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

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          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
      
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