定向改造菌果聚糖合成酶提高催化产物聚合度专一性的研究

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31100045
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    25.0万
  • 负责人：
    安迎锋
  • 依托单位：
    沈阳农业大学
  • 学科分类：
    C0102.微生物生理与生化
  • 结题年份：
    2014
  • 批准年份：
    2011
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2012-01-01 至2014-12-31

项目摘要

已知的菌果聚糖合成酶的催化产物专一性都很差，可同时产生两种不同聚合度的菌果聚糖。两种聚合度菌果聚糖都非常重要，但其功用差异明显，而造成这种聚合度差异的机理尚不清楚。如果能提高催化产物聚合度的专一性，则可达到提高单一聚糖产率，并方便产物分离纯化的目的。由于目前还不清楚哪些氨基酸位点能影响该酶催化产物聚合度专一性，因此很难通过定点突变实现酶结构的定向改造。本研究拟采用分子定向进化实现这一目的。首先将针对现有建库方法的缺点建立并运用新的两步改组法实现基因改组库的构建，并采用特异于菌果聚糖合成酶而设计的多步筛选法实现对基因改组库的筛选。在此基础上还将通过改变催化方式(酶的固定化和通透性全细胞催化)和优化催化条件来进一步提高酶定向催化的效率，并为酶的实际应用摸索条件。本研究的实现也将有助于阐明造成该酶催化产物聚合度差异的机理；并进一步拓宽分子定向进化的应用范围，为相关研究提供有益参考。

结项摘要

菌果聚糖合成酶可以催化蔗糖产生不同聚合度的菌果聚糖、低聚果糖和单糖。目前已经报道的菌果聚糖合成酶的活性和催化反应产物的专一性都较差，因此获得高活性和高催化产物专一性的酶具有重要的意义。由于目前还不清楚哪些氨基酸位点能影响该酶的活性和催化产物专一性，因此很难通过定点突变实现酶结构的定向改造。而本研究致力于采用分子定向进化方法结合酶的固定化来实现这一目的。本研究的成果包括：建立起了高效的土壤DNA提取和基因克隆新策略，成功实现了菌果聚糖合成酶基因的克隆；建立了高效的两步改组法，并以融合DNA克隆方式成功实现了菌果聚糖合成酶基因改组库的构建；首次利用蔗糖存在下的条件致死特性实现了对有活性的菌果聚糖合成酶的筛选和选择；采用薄层析法结合高效液相色谱成功筛选获得了活性和聚合度专一性均有提高的菌果聚糖合成酶；通过改组酶的固定化和通透性全细胞催化提高了酶的催化活性和热稳定性。同时，本研究所涉及的相关技术对同类研究也有重要的借鉴价值。

项目成果

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专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）

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其他文献

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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