PAR1对脑出血Src介导的NMDA受体酪氨酸磷酸化调控机制的研究

脑出血诱导Src的激活是导致神经元进一步损伤的关键。为了最大可能地争取出血后神经元的存活，本课题将探讨Src激活介导的损伤机制，以便针对性地纠正Src激活的功能异常，从而保护神经元。①研究将在动物模型上探讨脑出血激活凝血酶受体PAR1从而对Src激活的影响，利用免疫共沉淀、免疫印迹等方法和技术，探讨信号模块中蛋白质-蛋白质的相互作用，以及蛋白质可逆磷酸化对蛋白质间相互作用的调节，从而明确Src激活NR2A-PSD95-Src信号模块是脑出血早期神经元功能异常的一关键因素；②在活细胞水平使用免疫组化、电生理学技术，鉴定出血后NMDA受体的表达以及其介导的全细胞电流，探讨NMDA受体与神经元损伤之间的关系，明确NMDA受体的诱导表达在脑出血后神经细胞功能失常中的角色。通过证实以上假设，将针对性地纠正上述两个因素，为治疗出血性脑损伤提供新的思路并为筛选治疗药物提供新的靶点。

脑出血诱导Src的激活是导致神经元进一步损伤的关键。为了最大可能地争取出血后神经元的存活，本课题将探讨Src激活介导的损伤机制，以便针对性地纠正Src激活的功能异常，从而保护神经元。本课题采用大鼠自体鼠尾血（50 μl）注射尾壳核制备脑出血模型。利用免疫印迹、免疫沉淀、形态学染色、细胞膜片钳技术等方法，检测脑出血过程中，激酶Src、NMDA受体2A亚基的酪氨酸磷酸化的变化规律，及GluN2A，PSD95，Src三者结合的变化状态。应用的NMDA受体的拮抗剂MK-801、PSD95的反义寡核苷酸AS- PSD95、Src的抑制剂PP2和PAR-1受体激动剂活性肽SFLLR以及PAR-1受体抑制剂反活性肽RLLFS等探讨PAR-1通过Src介导对NMDA受体调控的脑出血的作用机制。腹腔注射苦瓜提取物苦瓜多糖（ MCP ）（75mg/kg），研究苦瓜多糖的脑保护作用。结果显示： （1）脑出血促进GluN2A，PSD95，Src三者信号模块的结合，增强Src和GluN2A的酪氨酸磷酸化水平。（2）PAR-1参与脑出血后GluN2A，PSD95，Src三者信号模块结合，并且PAR-1的抑制剂RLLFS抑制PSD95、Src和GluN2A三者信号模块的结合，降低Src和GluN2A的酪氨酸磷酸化水平，PAR-1的激活剂SFLLR能逆转RLLFS的抑制作用。（3）PAR-1参与脑出血Src介导的NMDA受体酪氨酸磷酸化的调控。（4）MCP能明显抑制GluN2A，PSD95，Src的结合以及对Src、GluN2A的酪氨酸磷酸化有明显的抑制作用，具有明显的脑保护作用。结果提示：1 脑出血过程中，PAR-1参与调控Src介导的NMDA受体酪氨酸磷酸化的机制；2 Src通过Src -PSD95- GluN2A信号模块调节NMDA受体的激活；3 PAR-1参与调控Src参与的Src -PSD95- GluN2A信号模块介导的NMDA受体酪氨酸磷酸化的机制；4 MCP通过抑制Src介导的NMDA受体酪氨酸磷酸化，有明显的脑保护作用。通过证实以上假设，将针对性地纠正上述两个因素，为治疗出血性脑损伤提供新的思路并为筛选治疗药物提供新的靶点。

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