制革脱毛酶的定向改造及作用机制研究

Unhairing process brought serious pollution, and enzyme application for replacing polluting chemicals in unhairing process attracted much attentions in recent years. However, the unhairing enzymes haven’t been accepted widely in actual production due to low purity,complex composition and poor stability. To solve these problems, unhairing enzyme is suggested to be improved by genetic modification in this project. High-keratinase-producing gene will be extracted from Bacillus Amyloliquefaciens strain, and transferred into Bacillus subtilis WB800 to construct recombinant strain, which produces unhairing enzyme without collagenase. Then the properties of modified unhairing enzyme will be analyzed and optimized. Furthermore, how modified unhairing enzyme act on unhairing process will be further studied. In addition, the relationship among the hide, modified unhairing enzyme and Ca2+/Na+ will be elucidated, while the activating effect, affecting factors and regulation method will be investigated. This research will promote the application of unhairing enzyme in leather production.

立足于目前制革行业的清洁化发展需求，为了有效解决目前脱毛过程中存在的固体废弃物污染问题，本项目以脱毛酶作为研究对象，针对脱毛过程中“提高脱毛酶专一性作用机制”的基础科学问题，使用基因工程手段从全新的角度提出了解决方案。在研究过程中，首先从具有高产角蛋白酶特性的解淀粉芽孢杆菌中提取角蛋白酶基因，对其进行定点突变，提高其催化活性与稳定性，然后将其在缺陷8种主要胞外蛋白酶的枯草芽孢杆菌WB600中进行异源表达，从而去除传统脱毛酶中存在的对胶原蛋白结构有破坏作用的酶组分；在此基础上优化发酵条件，得到对胶原无降解作用的新型脱毛酶，并对新型脱毛酶的作用机制进行总结；最后，阐述脱毛过程必须存在的金属离子Ca2+/Na+对脱毛酶作用的影响机制及脱毛体系皮-脱毛酶-Ca2+/Na2+之间的构效关系，为脱毛酶的研究和开发以及制革行业的革新奠定了理论基础。

脱毛工序是制革生产中污染最为严重的工序，利用酶替代传统脱毛方法中的使用的污染性化学品是制革工业的发展方向之一。而目前开发的脱毛酶大多存在纯度低、酶组分复杂、酶的稳定性差等问题，导致在使用过程中脱毛不完全或使皮出现烂面、松面等现象，严重影响了成品皮的质量，制约了其应用和推广范围。针对此问题，本项目通过分子生物学方法对制革脱毛酶进行改造，并对其在特定体系下的脱毛机制进行研究。首先，将来源于解淀粉芽孢杆菌的高产角蛋白酶基因KerT在缺失六种胞外蛋白酶的芽孢杆菌WB600中进行异源表达，降低了改造后菌株中所产酶系的胶原降解性蛋白酶含量。在此基础上，对产酶条件进行优化，并对所产酶的酶学性质进行研究。最后，通过构建模拟脱毛体系，对该体系的调控机制进行研究。.通过本项目的研究，成功获得对胶原结构低损伤的新型脱毛酶，其运用于制革脱毛过程相较于传统脱毛酶而言，具有更好的安全性；通过对新型脱毛酶的作用机制及模拟脱毛体系中的影响机制研究，能够为该酶在脱毛过程中的应用提供较好的理论依据。本项目推动了脱毛过程中使用生物酶制剂部分取代传统硫化碱，对实现脱毛过程的清洁化生产具有重要意义。

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