微生物天然产物生物合成中新颖氮-氮键合成酶的酶学机理及应用研究

Microbial natural producst is a important source for clinical drugs. The study of natural product biosynthetic pathways has greatly advanced our understanding of these basic chemical biology processes in nature and ability to manipulate these pathways for various applications. Although there has been significant advancement in theoretical and applied studies of natural product biosynthesis, nitrogen-nitrogen bond enzymatic formation remains enigmatic in nature, and has been one of the hottest topic in the field. Recently, we reported the first enzyme (piperazate synthase, PS) that can specifically catalyze N-N bond formation in a natural organic molecule. The aim of this proposed research is to investigate the enzymatic mechanism of PS, to study the structural and functional relationship of PS, and to develop biocatalysts for N-N bond formation. It is expected that the results from this research would provide an in-depth understanding of the unusual N-N bond formation in nature and assist the development of highly-efficient N-N bond forming biocatalysts.

微生物活性天然产物分子是现代临床药物的重要来源。对这些天然产物分子生物合成过程的研究极大地促进了我们对自然界中基本的化学生物学反应过程的理解和应用的能力。虽然生物合成基础理论和应用研究已经取得了长足的发展，然而天然产物有机分子中氮-氮（N-N）化学键基团的酶促生物合成机制至今依旧是一个谜，也是长期以来生物合成领域最热点的研究问题之一。本项目拟以申请人近期发现的自然界中第一个（也是至今唯一）能够特异性催化天然产物有机分子中N-N键形成的piperazate synthase酶家族为研究对象，深入解析其酶促反应机理；研究其结构与功能的关系；探索将其开发成N-N键合成生物催化剂的潜力等。本项目的实施将有助于深入理解自然界中N-N键形成这个独特的生化反应过程和挖掘绿色、高效的N-N键合成生物催化剂，因此本项目具有重要的基础理论和实际应用价值。

微生物次级代谢产物是药物的重要来源之一，其具有多样的生物活性和分子结构。氮-氮（N-N）键结构基团已经在数百种微生物天然产物结构中被发现，同时也是化学合成类药物最常见的结构单元。虽然氮-氮键的酶促合成机理长期以来是生物合成领域最热点的研究问题之一，但在本项目开始前其依然是处于理论空白阶段。六氢哒嗪-3-羧酸是非核糖体肽家族常见的一个结构单元，含有一个包含氮-氮键（肼基）的六元杂环。申请人前期发现了催化该分子中氮-氮键合成的六氢哒嗪酸合酶（piperazate synthase），本研究以该酶和其他相关的氮-氮键（肼基）合酶为研究对象，通过多种技术手段对它们催化生物化学反应进行详细的表征和酶促机理的研究。本研究发现六氢哒嗪酸合酶是一个同源二聚体，在二聚体界面上形成两个对称的活性中心，血红素辅基通过铁离子与蛋白组氨酸残基形成配位。六氢哒嗪酸合酶与底物羟化鸟氨酸的共晶结构显示羟化鸟氨酸通过其N5位氮原子与血红素铁进行配位。研究进一步发现六氢哒嗪酸合酶能够与一系列化学合成的羟胺（hydroxylamine）底物反应，催化的反应类型具有底物依赖性。综合实验和理论计算结果，本研究显示六氢哒嗪酸合酶首先介导羟胺底物的脱水反应，形成一个罕见的氮卡宾（nitrene）中间体。当以羟化鸟氨酸作为底物时，其alpha-氨基进攻氮卡宾形成氮-氮键；当是其他羟胺底物时，氮卡宾发生异构形成亚胺后水解脱氨。本研究还进一步揭示了另一种新型双功能域的氮-氮键（肼基）合酶的酶促反应机理。该酶属于cupin蛋白家族，催化锌离子依赖的分子内重排反应，将不稳定的酯底物中氮-氧键断裂并形成新的氮-氮键。综上所述，本研究在国际上首次揭示了微生物活性天然产物中氮-氮键（肼基）酶促合成的分子机理，填补了相关的理论空白，形成了一系列具有高度原创性的成果，为氮-氮键合成酶类进一步在生物催化领域的应用奠定了理论基础。

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