低盐发酵酸鱼典型产胺微生物促生物胺形成机制研究

Low-salt fermented Suan yu is a traditional fermented aquatic product in the minority nationalities of south-western China, extensively produced acid, rich in free amino acid and prone to being contaminated by bacteria due to low-salt, which provides favorable conditions for synthesis of biogenic amines. However, at present, the formation and accumulation mechanism of biogenic amines in low-salt fermented Suan yu therein still remain undefined. With the traditional low-salt fermented Suan yu as the research object, the effect of species and quantities of microorganisms of the Suan yu fermentation process, and biodegradation and control of biogenic amines were analyzed. Through selection typical microbial producing biogenic amine, investigation the ability producing biogenic amines. Through cloning, expression and enzyme character of amino acid decarboxylase from low-salt fermented Suan yu, and research of the properties and structure of obtaining recombinant protein and the separation of amino acid decarboxylase enzymology. Thus study the formation of biogenic amines in Suan yu from the aspects of microorganism and genetic level. The research offers a certain theoretical foundation for revealing formation mechanism of biogenic amines, determining the technique of biogenic amine control in low-salt fermented Suan yu, and industrializing the Suan yu products eventually.

低盐发酵酸鱼是我国西南少数民族地区一种传统的发酵水产品，但由于该产品低盐、易污染微生物、易产酸及富含游离氨基酸的特点，为生物胺的合成提供了良好的条件。然而，目前对低盐发酵酸鱼生物胺的形成机理研究还很缺乏。本研究以贵州传统低盐发酵酸鱼为研究对象，重点考察发酵过程中微生物种类、数量对生物胺形成的影响，通过对筛选获得的典型产胺微生物产胺性能，降解及控制生物胺分析，再通过对典型产胺菌株氨基酸脱羧酶基因克隆表达，对获取的重组蛋白及分离的氨基酸脱羧酶的酶学性质及结构研究，以求从微生物和基因层面探讨影响低盐发酵酸鱼生物胺的形成机制。本研究对于揭示低盐发酵酸鱼生物胺的形成机理，为确定控制酸鱼生物胺技术、建立工业化生产酸鱼制品提供一定的理论基础。

生物胺的形成是低盐发酵酸鱼重要的安全隐患之一，主要由部分具有氨基酸脱羧酶活性的微生物产生，但目前对影响其形成机理研究机理尚不明确。本项目采用显色培养基和高效液相色谱法筛选典型产胺菌，研究鉴定产胺菌的菌种特性及模拟发酵，获得23 株分别高产腐胺、尸胺和组胺的菌株，隶属肠杆菌属、克雷伯菌属等12 个菌种，其产胺菌积累生物胺的能力具有菌株特异性。PCA多元分析得出pH、温度和盐含量依次是影响产胺菌产胺能力的主要因素。模拟发酵组通过Cytoscape制作的各理化指标与生物胺之间的关联网络图，明确了各理化指标之间的相关性导致生物胺形成的复杂性。另外，通过聚合酶链氏反应（PCR）对氨基酸脱羧酶基因多样性、pH对肠细菌产胺类型、产胺能力及酸胁迫产胺途径，通过典型产胺的K. aerogenes 10C2 组氨酸脱羧酶的酶学性质，通过基因克隆和生物信息学分析其生物胺分子形成机制研究。97株产胺菌株按产胺能力的强弱分为4个等级，产胺能力依次为腐胺、组胺和尸胺，27 株高产生物胺的氨基酸脱羧酶基因型均携带 odc、speA、speB、adiA 和ldc基因，13株携带 hdc基因。pH显著影响产胺菌的产胺类型和能力，各产胺途径相互协作抵抗酸环境。K. aerogenes 10C2 组氨酸脱羧酶的最适温度和pH分别是45℃， 6.0，热稳定性范围在 4-30℃，pH稳定性范围5.0-8.0，Mg2+可以提高该菌的组氨酸脱羧酶活。编码该酶的核酸序列长度为 1137 bp，蛋白质大小约为44KDa。该酶位于细胞质，分子式为 C1905H2914N510O558S17，分子质量为 42434.20，该蛋白等电点理论值为 5.86，脂肪系数是84.68，总平均亲水性为-0.176，由 378 个氨基酸组成的，有 11 个激酶磷酸化位点、无信号肽、无跨膜结构，α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲结构贯穿整个氨基酸链，其中最多的是α-螺旋（Hh）和无规则卷曲结构（Cc），Hh 有 151 个氨基酸，占 39.95%，Cc有 150 个氨基酸，占 39.68%.

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