小分子化合物靶向SF-1促间充质干细胞诱导分化为Leydig样细胞的实验研究

Male primary hypogonadism causes testesterone deficiency and affects the physical development and living quality. Leydig cell transplantation is a potential treatment of this disease. Our previous study showed that by stepwise induction, HuMSCs could differentiate into functional Leydig cells in vitro, however with low efficiency. It could be improved through gene transfection but is lack of safety. Latest research found that some small molecules could promote the induction through specific signaling pathways. Significantly, 24-exo was one of them which could enhance the induction by activating the key factor SF-1 as its ligand. Therefore, this study aims to induce HuMSCs to Leydig-like cells with 24-exo and clarify the major effect of SF-1 during the process. Furthermore, an in-vivo experiment would be carried out in hypogonadism mouse model to explore the treatment effect of induced cell transplantation. The findings of this study will provide evidence for the promotion effect of 24-exo in the induction of HuMSCs to Leydig-like cells and reveal its mechanism. Eventually, it will give recommendation to the cell transplantation treatment of male primary hypogonadism.

男性原发性性腺功能低下症造成睾酮缺乏，影响发育与生活。Leydig细胞移植具有一定的治疗前景。前期实验证实，体外条件下HuMSC可以被分步诱导为功能性Leydig样细胞，但诱导效率低下。基因转染虽可提高诱导效率，但安全性不足。最新研究发现，一些小分子化合物能通过信号通路等特定机制促进细胞诱导转化，具备多种独特的优点。其中，24-exo可以作为配体靶向激活HuMSC诱导过程中的关键因子SF-1，显著提高干细胞的分化效率。因此，本课题拟在前期研究的基础上，联合24-exo促进诱导HuMSC分化为Leydig样细胞，并对SF-1在其中的关键作用进行研究论证。同时结合体内实验，探讨诱导细胞移植对原发性性腺功能低下症小鼠模型的治疗意义。实验成果为24-exo促进HuMSC定向诱导分化为Leydig样细胞提供依据并揭示其作用机制，为男性原发性性腺功能低下症的细胞移植治疗提供参考。

本课题组通过基因编辑技术、SF-1 联合和小分子化合物以及小分子化合物组合，成功实现了睾丸间质细胞的转分化。 . 我们首先分离了人脐带间充质干细胞（hUMSCs）和人包皮成纤维细胞（HFFs）作为种子细胞，利用基因编辑技术对人包皮成纤维细进行重编程，实验结果显示，sgRNA 慢病毒感染后细胞开始具有睾酮合成能力，表观遗传学分析发现，靶基因启动子区局部组蛋白乙酰化水平（H3K27ac）和甲基化水平（H3K4me3）明显改变。这些转分化的细胞可在去势大鼠的睾丸白膜腔内定植存活，并恢复大鼠血清睾酮水平。 . 接下来，我们利用采取联合 SF-1 慢病毒转染和小分子化合物的方法对成纤维细胞进行诱导，结果发现SF-1联合Forskolin，DAPT，Purmorphamine可以成功诱导呈现为发生转分化为可产生睾酮的Leydig样细胞。 . 后续我们靶向筛选激活SF-1基因表达的小分子化合物，结果发现单个小分子实现SF-1基因的激活十分困难，因此我们确定了以 Forskolin，DAPT，Purmorphamine 为基础的多种小分子化合物的联合诱导方案，并通过对药物进一步筛选以及对药物浓度的优化，最终确定了“6C”小分子化物组合可以成功将成纤维细胞转分化为具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞。在白膜去势的小鼠性腺功能低下模型中，这些移植的细胞依然存活且表达睾丸间质细胞标记物，可以有效恢复模型小鼠的睾酮水平。最后我们对小分子化合物诱导成纤维细胞重编程过程的表观遗传学机制进行探究，利用RNA-seq和ChIP-seq联合分析发现 rap1 和 ras 相关信号通路可能在小分子化合物诱导过程中具有重要的作用，在后续课题中我们将进一步探究上述通路在细胞重编程中的意义。

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