自噬通过B7-1调控足细胞肌动蛋白骨架重排的分子机制

Glomerular diseases are commonly characterized by proteinuria which is a high risk factor leading to the end stage renal disease.It has been well known that the depolymerization of podocyte actin cytoskeleton is associated with proteinuria. Our previous study showed that the inhibition of autophagy led to more severe actin cytoskeleton damage in puromycin aminonucleoside-treated podocytes, whereas the disorganized actin cytoskeleton can be partially reversed after induction of autophagy. Nonetheless,the underlying mechanism remains unknown. Recently B7-1 has been regarded as the key factor in podocyte cytoskeleton injury and is controlled by the upstream proteins TLR3 and TLR4. Moreover, autophagy inhibits TLR signalling pathways. Therefore, we propose that autophagy alleviates the depolymerization of podocyte actin cytoskeleton via B7-1. In order to verify this hypothesis, Human podocyte cell line will be cultured for investigating how autophagy affects the expression and distribution of B7-1, and further verifying the role of B7-1 in dynamics of podocyte actin cytoskeleton mediated by autophagy. Meanwhile, the related signalling pathways will be elucidated.The techniques in this project include overexpression, siRNA interference and so on. This novelty project explores the protective mechanism for podocyte cytoskeleton in terms of autophagy,it may shed new lights on decreasing proteinuria in future.

蛋白尿是肾小球疾病的主要临床特征，也是进展至终末期肾病的独立危险因素。现公认足细胞肌动蛋白骨架重排与蛋白尿的产生密切相关，但迄今缺乏有效的逆转措施。我们前期研究发现抑制自噬可加剧嘌呤霉素氨基核苷诱发的足细胞肌动蛋白骨架重排，反之，诱导足细胞自噬则可减轻该骨架的损伤，但其分子机制有待阐明。新近发现足细胞B7-1是影响肌动蛋白骨架稳定性的关键蛋白，受TLR3和TLR4的调控；而自噬的激活可抑制TLR信号通路。我们推测：足细胞自噬可能通过B7-1调控肌动蛋白骨架重排。为此本研究拟采用体外培养的人足细胞株，通过基因克隆、siRNA干扰等技术，观察自噬对足细胞B7-1表达与分布的影响，进而分析B7-1在介导自噬调控足细胞肌动蛋白骨架重排中的作用，并探索参与该过程的相关信号通路。本研究以细胞自噬为切入点，探讨足细胞自噬对肌动蛋白骨架结构的保护作用及其分子机制，从而为蛋白尿的防治提供新思路。

蛋白尿是肾小球疾病的主要临床特征，也是患者进展至终末期肾病的独立危险因素，消除蛋白尿是该类疾病的治疗重点。现已知肾小球滤过膜的损伤与蛋白尿的形成密切相关，国内外已认同：足细胞损伤是产生肾小球性蛋白尿的主因。足细胞结构特异，其末端的足突仅由肌动蛋白骨架支撑。足细胞肌动蛋白骨架以肌动蛋白微丝(Filamentous actin, F-actin)为关键组分，通过α-actinin-4、Synaptopodin等骨架相关蛋白组建成有序的网状结构，并分别与足突顶端、裂孔隔膜和基底膜区域的足突蛋白分子相连。 足细胞肌动蛋白骨架重排是蛋白尿发生的关键机制，而抑制该骨架结构重排则将成为防治肾小球性蛋白尿的突破口。细胞自噬(Autophagy)是一种溶酶体介导的细胞自身降解胞内异常细胞器或有害刺激物的代谢过程，自噬完成后的降解产物可作为细胞的能量来源，维护细胞正常功能与稳态。我们的前期结果发现细胞自噬是足细胞内重要的保护机制，但细胞自噬如何影响足细胞肌动蛋白骨架，以及什么信号通路参与了这一调控过程尚无研究报道。本项目研究了自噬对足细胞B7-1表达、肌动蛋白骨架形态与功能的影响，以及B7-1在自噬调控足细胞肌动蛋白骨架重排中的作用。结果发现: 抑制细胞自噬可导致足细胞肌动蛋白骨架重排和足细胞凋亡比例升高，而诱导自噬对足细胞肌动蛋白骨架和凋亡无影响；抑制自噬降低足细胞的迁移能力，但未改变其粘附能力。足细胞自噬被氯喹(CQ)抑制后，B7-1的表达升高，足细胞骨架蛋白alpha-actinin-4, CD2AP，Podocalyxin和Synaptopodin的表达无变化；而当自噬被3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制后，B7-1的表达升高，Synaptopodin表达下降，alpha-actinin-4, CD2AP和Podocalyxin表达无改变。当B7-1表达敲低或过表达后，自噬抑制仍能导致足细胞肌动蛋白骨架重排；抑制自噬降低了足细胞肌动蛋白骨架调控因子RhoA, Rac1 and CDC42的活化水平。因此，本项目研究结果提示B7-1并不是自噬调控足细胞肌动蛋白骨架稳定性的关键蛋白，而RhoA, Rac1 and CDC42可能介导了自噬影响足细胞肌动蛋白骨架的重排。本项目研究不仅丰富了蛋白尿的发病机制，还将为今后的治疗提供新思路。

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