长链非编码LINC00978吸附miR-144-3p调控Nrf2参与妊娠期糖尿病子代胰岛素抵抗的机制研究

LINC00978, a long non-coding RNA(lncRNA) screened by lncRNA chip in our previous study, has been validated down-regulated in umbilical cord blood of gestational diabetes mellitus(GDM) via qRT-PCR.The KEGG Pathway enrichment analysis showed that the potential target of LINC00978 was involved in oxidative stress. Nrf2 plays an crucial role in oxidative stress. Our previous experiments found that the expression of Nrf2 in umbilical cord blood of GDM was down-regulated, which was related to the offspring insulin resistance (IR) of GDM.Cell experiments showed that LINC00978 could regulate the expression of Nrf2.Bioinformatics analysis showed that mir-144-3p could bind to both LINC00978 and Nrf2, and in situ fluorescence hybridization experiment showed that LINC00978 could bind to mir-144-3p as well, which was up-regulated in GDM umbilical cord blood. Therefore, we hypothesized that LINC00978, as a ceRNA, sponged miR-144-3p to regulate Nrf2 gene expression and subsequently participate in the pathogenesis of IR in GDM offsprings. In this project, cell and animal models were used to validate the etiological network that LINC00978 could sponge mir-144-3p to regulate Nrf2 gene expression and subsequently lead to IR in the GDM offsprings, and finally provide new theory and therapeutic target for the prevention and treatment of IR in GDM offspring.

我们通过芯片筛选和qRT-PCR已证实LINC00978在GDM脐血中表达下调，KEGG Pathway富集分析其目标靶点涉及氧化应激。Nrf2在氧化应激中扮演重要角色，前期实验发现GDM脐血中Nrf2表达下调，与GDM子代胰岛素抵抗（IR）有关。细胞实验发现LINC00978可调控Nrf2的表达。生物信息学分析发现miR-144-3p与LINC00978和Nrf2均有碱基结合位点，原位荧光杂交共定位发现LINC00978可结合miR-144-3p；脐血验证miR-144-3p在GDM中高表达。据此，课题组提出LINC00978作为ceRNA海绵吸附miR-144-3p调控Nrf2基因的表达参与GDM子代IR发病机制的设想。本项目拟通过细胞和动物模型，验证LINC00978吸附miR-144-3p调控Nrf2导致GDM子代IR的病因学网络，为GDM子代IR的防治提供提供新的思路和治疗靶点。

妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus，GDM）是妊娠中晚期首次发现的碳水化合物不耐受的代谢性疾病，是常见的妊娠期并发症之一。随着女性肥胖的发生率增加，GDM的发病率也逐年升高。GDM的子代发生心血管风险以及代谢综合征的概率也高于正常妊娠子代，但是对于其表观遗传学机制研究主要集中于DNA甲基化，对于非编码RNA以及RNA甲基化的研究相对缺乏。因此本实验在GDM模型小鼠的基础上研究了非编码RNA以及m6A对于GDM子代代谢综合征发生的影响以及其机制。通过实验我们发现高脂饮食喂养成功建立的GDM模型组12周龄的F1代小鼠出现明显的葡萄糖耐量异常以及胰岛素抵抗等表型，同时GDM组胎鼠肝脏组织m6A整体甲基化水平升高。通过PCR阵列分析筛选出RBM15为差异最明显的m6A甲基化转移酶。同时我们发现GDM组12周龄F1代小鼠肝脏组织肝小叶结模糊，且出现明显空泡； GDM组12周龄F1代小鼠可见糖原沉积；孕18.5天和12周龄子代鼠均存在部分氨基酸以及部分不饱和脂肪酸代谢异常。MeRIP-Seq提示GDM组和对照组有13053个重叠峰，且m6A差异峰主要分布在3’非翻译区域（3’UTR）；筛选既具有差异m6A峰又具有差异mRNA表达的基因共201个，GO分析和KEGG分析发现这些差异基因主要富集于代谢相关通路。在正常肝细胞系LO2细胞中敲降RBM15发现葡萄糖摄取量增加，胰岛素敏感性增强，胰岛素抵抗降低；过表达RBM15后发现葡萄糖摄取量减少，胰岛素敏感性降低。总体而言，我们的研究证明了GDM子代小鼠的代谢出现异常，较对照组更易产生胰岛素抵抗，同时探索了RBM15 通过 m6A 修饰在 GDM 小鼠后代代谢综合征进展中的作用。RBM15的高表达能够抑制肝脏胰岛素敏感性，增强胰岛素抵抗。 此外，我们表征了 GDM 胎儿肝脏和对照之间的差异 m6A 甲基化，表明 m6A 甲基化与肝脏中糖脂代谢的调节之间存在潜在关联，因此为未来研究 GDM 后代代谢紊乱提供了基础。

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