长效胰高糖素样多肽-1在毕赤酵母表达过程中的N端降解机制

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31000016
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    19.0万
  • 负责人：
    窦文芳
  • 依托单位：
    江南大学
  • 学科分类：
    C0103.微生物组学与代谢
  • 结题年份：
    2013
  • 批准年份：
    2010
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2011-01-01 至2013-12-31

项目摘要

本课题拟应用系统生物学原理，采用反向代谢工程的手段研究长效人胰高血糖素样肽-1表达过程的N 端降解问题。首先对已构建的表达长效人胰高血糖素样肽-1药物分子的重组毕赤酵母菌株进行传统诱变，通过高通量筛选获得表达量及N端降解程度等表型明显不同的突变株；应用蛋白组学技术分析不同表型突变株之间的蛋白表达谱差异，利用生物信息学结合肽谱测序技术确定影响白蛋白融合蛋白药物分子降解的关键差异蛋白（基因型）的范围；在此基础上，提出理性的毕赤酵母表达宿主的改造策略，并进行初步尝试，以期获得高表达低降解的长效人胰高血糖素样肽-1药物分子的毕赤酵母表达体系。本课题的实施可以对毕赤酵母降解蛋白药物分子相关途径进行较为系统性研究，预期可以提出理性的毕赤酵母表达宿主的改造策略，为解决毕赤酵母表达外源蛋白过程中目的分子的降解问题提供新的思路和技术手段。

结项摘要

毕赤酵母宿主对蛋白药物分子的降解已成为限制其成药性共性问题。本课题首先建立了双层硝酸纤维素膜结合抗体筛选的模型，筛选获得了表达量较高提高了20-30%，且N端降解程度不同的菌株，利用蛋白质组学技术在不同降解程度的突变株的胞内可溶性蛋白中共鉴定了32个差异蛋白，包括与碳源代谢、氨基酸代谢、能量代谢、翻译、次级代谢相关的蛋白及一些未知功能的蛋白,有STE13及YSP1基因与蛋白的N端降解相关。而后采用基于PCR技术介导的Cre-Loxp系统重组技术成功敲除宿主菌GS115的STE13基因，得到STE13缺陷型菌株GS115/D13。纯化产物生物活性实验结果显示，在相同的给药浓度梯度情况下，STE13基因缺陷型菌株GS115/D13中表达产物GGH刺激细胞株产生的cAMP值远高于出发菌株的GGH，表明STE13基因缺陷型GS115/D13菌株GGH生物活性较出发菌株生物活性有明显的提高。并针对上述结果及N端降阶的特性型设计了相关的地融合蛋白GGH类似物，进行了5种方法的延长修饰，即DAH-GGH、MSY-GGH、TFT-GGH、A-GGH和G-GGH，体外活性结果显示TFT-GGH，A-GGH与G-GGH均可以显著的促进cAMP的生成，且A-GGH与G-GGH的体外活性比母体蛋白GGH提高了10倍。小鼠体内糖耐量实验结果表明A-GGH与G-GGH还可以显著控制KM小鼠口服葡萄糖后血糖的增幅，而且类似物A-GGH在给药24 h后仍可以显著的发挥控制血糖增高的效果。综上所述，应用系统生物学原理结合反向代谢工程的手段研究长效人胰高血糖素样肽-1的降解问题。发表论文6篇，其中SCI 1篇，CSCD 5篇，申请专利1篇，达到了预期目标。

项目成果

期刊论文数量（0）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）

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其他文献

钝齿棒杆菌N-乙酰鸟氨酸转氨酶的克隆表达分析及其重组菌的精氨酸发酵
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  • 发表时间：
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  • 期刊：
    生物工程学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    徐美娟;张显;饶志明;杨娟;窦文芳;金坚;许正宏
  • 通讯作者：
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结合缺陷型菌株显色法采用离子束诱变筛选高产L-精氨酸突变株
  • DOI：
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  • 发表时间：
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  • 期刊：
    微生物学通报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    杨娟;饶志明;徐美娟;夏海锋;窦文芳;许正宏
  • 通讯作者：
    许正宏
钝齿棒杆菌精氨酸琥珀酸酶编码基因argH的克隆表达及其重组菌发酵产精氨酸研究
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  • 期刊：
    中国生物工程杂志
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  • 作者：
    饶志明;徐美娟;陆元修;周晨;蓝春燕;窦文芳;张晓梅;许泓瑜;许正宏
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    许正宏
钝齿棒杆菌乙酰谷氨酸激酶编码基因argB的克隆表达、纯化及酶学性质研究
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    工业微生物
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  • 作者：
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  • 通讯作者：
    许正宏

其他文献

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

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          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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