鉴定小开放阅读框编码肽的top-down与从头测序质谱方法研究

In recent years, it has been widely reported that the short/small open reading frames (smORFs) exist in the ‘non-coding regions’ of human and other model organisms, which can encode polypeptides (SEPs) with a length less than 150 amino acids residues. A small number of well-studied SEPs have indicated that these polypeptides may act as important regulators in many fundamental biological processes such as metabolism, development and cell apoptosis. Nowadays, only 348 SEPs have been detected in human tumour cells based on bottom-up proteomics and database search, which accounts for 20% less of computational prediction. In addition, the lower sequence coverage impedes profound excavation on the SEPs expression features. Therefore, it is calling for analytical method for large scale detection of complete SEPs. According to the short sequence and lower molecular mass characteristics of SEPs, we tend to exploit a top-down approach to detect SEPs based on multidimensional liquid chromatography separation and mass spectrometric analysis, which will obtain the complete sequence coverage of SEPs. Furthermore, peptide de novo sequencing that is independent from database is also considered in the data processing to discover more novel SEPs. The integration of above mentioned analytic strategy will create a new method to improve the number and coverage rate of SEPs in large scale, and provides new means and data support for the further functional study of SPEs.

近年来，研究表明人类以及其它模式生物的“非编码区”上存在小开放阅读框，能够编码产生长度在150个氨基酸以下的肽段(SEPs)，而且部分肽段已被证实在代谢、发育以及细胞凋亡等生物学过程中扮演重要角色。目前基于“bottom-up”以及数据库检索的策略在人类肿瘤细胞中鉴定到348个SEPs，不及预测数量的20%，而且较低的序列覆盖率不利于深入挖掘SEPs的表达特征。因此，急需建立大规模、准确鉴定完整SEPs的分析方法。根据SEPs序列短、分子量小的特点，本项目拟在前人工作基础上，通过多维液相色谱分离与质谱联用进一步开发SEPs的“top-down”分析方法，实现全序列覆盖率检测。此外，在数据处理上辅以从头测序，发挥其不依赖数据库检索的优势，鉴定全新的SEPs。通过上述不同分析策略的整合，从而探索出大规模提高SEPs鉴定数量和覆盖率的新方法，为深入开展SEPs功能研究提供技术和数据支持。

目前许多研究表明小型开放阅读框能够编码产生短的肽链(smORFs encoding polypeptides，SEPs)。SEPs 的产生机制、保守性等特征以及生物学功能对研究生命体的发育和进化有着重要意义。传统的基因注释算法存在对短序列smORFs的歧视。此外，smORFs 的可能使用非经典起始密码子且在RNA上的位置具有多种多样，这些特征导致其编码的SEPs 具有序列短、表达量低以及变异性大等特点。目前的质谱分析策略制约了新型SEPs 的发现，而且不足以实现SEPs的全序列覆盖以及同源SEPs 的区分。针对此现状，本项目拟提高小开放阅读框编码肽鉴定的数量以及覆盖率。首先，我们利用有机溶剂乙腈（ACN）和盐酸（HCl）进行SEPs的提取和富集，结合小分子蛋白凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE）和静电排斥亲水色谱（ERLIC）分馏两种分离方法，在人类肝癌细胞系Hep3B中进行小开放阅读框编码肽进行了鉴定。不同方法联用能够实现优势互补从而提高小开放阅读框编码肽的鉴定数量。在本次实验中，共得到了285个独特肽段，对应271个新鉴定的SEPs。结合转录本及基因上的定位信息分析发现，在新鉴定到的271个SEPs中有85%均由过去认为的非编码区域编码产生。随后，我们通过top-down和从头测序来分析SEP，以提高SEP的数量和序列覆盖率。通过top-down的方法鉴定了241个人类SEP，具有很高的序列覆盖率。基于自下而上的数据库搜索得到的多肽平均长度为19个氨基酸(AA)；通过从头测序得到的平均长度为9AA；通过top-down的方法得到的多肽的平均长度为25AA。较长的肽段提高了序列覆盖率，能够更有效地区分SEPs和已知的基因编码序列。top-down的方法在鉴定K/R序列或高K/R含量肽段方面有优势。综上所述，本项目同时采用“bottom-up”以及“Top-down”这两种不同分析策略，并整合数据库检索以及从头测序这两种不同数据处理方法的结果，建立一套高效、大规模SEPs 鉴定方法，提高了SEPs 的鉴定序列覆盖率、准确性以及数量。高序列覆盖率的新SEPs对于阐明新蛋白的产生机制具有重要意义，也是进一步开展功能研究的基础。

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