基于“肾藏精”理论研究补肾填精法通过细胞周期蛋白D调控小鼠精原干细胞增殖的作用机制

Spermatogonia stem cell（SSC）is the material basis of kidney's congenital essence. It is recently found that cyclin D plays an important role in SSC’s proliferation. The expression of cyclin D is up-regulated through PI3K-Akt pathway. Cyclin D influences on G1 phase and impels the transition from G1 phase to S phase. Previously, we demonstrated that kidney reinforcing drug, Yangjing capsule, could stimulate SSC to proliferate through PI3K-Akt pathway. Furthermore, SSC infected by adenovirus carrying cyclin D small interference RNA shown low proliferating activity. Therefore, we hypothesized that kidney reinforcing medicine could stimulate proliferation of SSC through PI3K-Akt pathway by up-regulation of cyclin D. This study intends to use adult male mice, cell experiments, and small interfering RNA technology to further study the effect of kidney reinforcing drug on the expression , location and promotor of cyclin D. Then it can be identified that whether it is through the role of cyclin D to stimulate proliferation of SSC. The molecular mechanisms that kidney reinforcing medicine on SSC function would be clarified. In conclusion, the study would contribute to elaborate the scientific connotation of “kidney storing essence”, and use Chinese medicine to treat male infertility caused by oligoasthenotspermia.

精原干细胞（SSC）是肾中所藏先天之精的物质基础，近年发现，细胞周期蛋白D（cyclin D）在SSC增殖中发挥着重要作用，PI3K-Akt通路传递的信号上调cyclin D的表达，使细胞顺利通过G1期进入S期，产生增殖效应。前期研究表明，补肾填精中药—养精胶囊能够通过PI3K-Akt通路促进SSC增殖，另外，将携带有cyclin D干扰片段的腺病毒感染SSC发现增殖活性降低，所以课题组推测补肾填精中药可能是通过PI3K-Akt通路上调cyclin D的表达来调控SSC的增殖功能。本研究拟利用成年雄性小鼠、细胞实验及小干扰RNA技术，进一步研究补肾填精中药对cyclin D的表达、定位和上游启动子的影响，明确是否通过cyclin D促进SSC的增殖，进而阐明补肾填精中药调控SSC功能的分子机制。这对于揭示“肾藏精”的科学内涵，应用中医药治疗由少弱精症引起的男性不育具有重要的理论和现实意义。

精子质量问题是男性不育最主要的病因，传统中医认为，精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是肾中所藏先天之精的物质基础，补肾填精法是治疗少弱精症引起的男性不育的根本大法，课题组研究了补肾填精中药养精胶囊对于SSCs增殖的影响以及具体的分子机制。课题组建立了稳定的小鼠原代SSCs培养平台以及中药提取技术，为实验的开展提供了可靠的支持。研究表明，0.01、0.1、1 mg/mL浓度的养精胶囊在24、36、48 h三个时间点可以促进SSCs的增殖，因此，后续实验选用0.01、0.1、1 mg/mL这三种浓度作为养精胶囊的低、中、高浓度进行。养精胶囊（1 mg/mL）和阳性对照GDNF（20 ng/mL）作用细胞48 h后，能通过提高S期细胞比例促进细胞增殖。荧光素酶报告基因实验表明，养精胶囊和GDNF可以提高cyclin D1启动子的活性，细胞免疫荧光的结果表明，养精胶囊和GDNF可以增加细胞核内cyclin D1蛋白的表达。而加入腺病毒介导的Ad-sh-cyclin D1预处理后再加入养精胶囊培养48h，细胞的增殖活性降低，S期细胞比例减少，cyclin D1的启动子活性降低，cyclin D1表达减少，表明Ad-shRNA-cyclin D1能够抑制小鼠SSCs的增殖。接下来采用PI3K阻断剂LY294002阻断PI3K-Akt通路，加入LY294002预处理后再加入养精胶囊培养48h，细胞的增殖活性降低，S期细胞比例减少，p-Akt/Akt和cyclin D1的表达减少，表明养精胶囊通过PI3K-Akt-cyclin D1通路作用于小鼠SSCs。接下来，课题组采用环磷酰胺成功诱导生精障碍的小鼠模型，发现养精胶囊可以改善模型小鼠的精子浓度、活力，降低精子畸形率，减少生精细胞凋亡，促进cyclin D1的表达。因此，补肾填精中药养精胶囊可以通过PI3K-Akt通路作用于cyclin D1，进而促进SSCs增殖。这对于揭示“肾藏精”的科学内涵、明确补肾填精中药改善生精功能的分子机制以及应用中医药治疗由少弱精症均具有重要的理论和现实意义。

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