新型Smo CRD抑制剂的发现及抗髓母细胞瘤活性研究

Medulloblastoma (MB) is the most common malignant brain tumor in children and the Sonic hedgehog (Shh) subgroup is one of the four subgroups in MB, which is characterized by constitutive activation of Hedgehog (Hh) signaling pathway. Over the past decade, Smo inhibitors showed good potency in MB, however, currently due to the Smo 7TM mutations, they are limited by drug resistance. Sterol-related derivatives inhibit Hh signaling pathway by binding the cysteine-rich domain (CRD) of Smo and still remain effective on the Smo mutant models. Therefore, finding some novel Smo CRD inhibitors could be a valid approach to overcome drug-resistance. Three novel steroidal alkaloids, obtained from Veratrum grandiflorum, exhibited significantly inhibition activities in Hh signaling pathway. The preliminary results of biological activities and molecular docking simulation suggested that these alkaloids could be Smo CRD inhibitors and have a great potential on drug-resistance. Based on the previous work, the separation and purification of active steroid alkaloids from V. grandiflorum will be guided by dual-luciferase reporter assay system, focusing on the separation of new or active steroid alkaloids; to investigate the binding sites on Smo and the effect on drug-resistance by competitive binding assay and gene mutation; then the anti-medulloblastoma activities in vitro and structure-activity relationships (SARs) will be evaluated. All research work we do aims to put a foundation for the development of novel anti-medulloblastoma drugs against drug-resistance.

髓母细胞瘤（MB）是儿童中最常见的脑部恶性肿瘤，其Shh亚型以Hedgehog (Hh)信号通路的连续激活为显著特征，目前的治疗药物多为Smo抑制剂，虽疗效显著，但易在Smo 7TM发生突变而耐药。固醇衍生物通过结合Smo CRD抑制Hh通路活性且在Smo突变模型中仍有效果。因此，寻找Smo CRD抑制剂是抵抗Smo突变耐药的一条有效途径。前期从毛叶藜芦中分离得到3个新生物碱且均显著抑制Hh信号通路活性；通过生物活性和分子对接模拟，发现它们很可能是Smo CRD抑制剂且具有抵抗突变耐药的潜能。本项目拟在前期工作基础上，采用荧光素酶报告基因活性系统引导毛叶藜芦系统地分离和纯化，重点是新型具有Hh信号通路抑制活性的生物碱分离；利用竞争性结合实验和基因突变技术阐明生物碱是否作用于Smo CRD和抵抗Smo突变耐药；并进行体外抗MB活性评价和构效关系研究，为获得抵抗耐药的抗MB药物提供候选化合物。

Shh亚型髓母细胞瘤（MB）是一种以Hedgehog（Hh）信号通路异常激活为显著特征的儿童常见脑部恶性肿瘤。靶向Hh信号通路抑制剂已成为抗MB药物研究的热点。但是，目前已上市的Hh通路抑制剂多由于Smo 7TM区域发生突变产生耐药而应用限制，而类固醇衍生物可通过结合Smo CRD在Smo突变模型中仍发挥Hh通路抑制活性。因此，寻找靶向Smo CRD的Hh通路抑制剂是抵抗Smo耐药的一条有效途径。在前期研究基础上，本项目发现：.1. 从中药毛叶藜芦（Veratrum grandiflorum Loes.）中分离纯化并获得10个甾体生物碱（化合物1-10），通过1H-NMR、13C-NMR，二维NMR等多种光谱技术确定了它们的化学结构。其中，化合物1-3为新化合物，与化合物4-6，8-9同为从毛叶藜芦中首次发现。.2. 化合物1-10均具有显著的Hh信号通路抑制活性，IC50值为0.57~14.31 μM。其中以化合物10的抑制活性最佳。.3. 化合物1-10均可显著减弱BODIPY-cyclopamine与Smo结合的平均荧光强度，表明它们直接作用于Smo，其中以化合物3、7和10的结合力较强。除化合物7外，其余化合物均为首次发现的天然Smo抑制剂。.4. 通过构建过表达Smo D473H 和W535L点突变的细胞模型，发现除化合物3外，其余化合物仍表现显著Hh信号通路抑制活性，尤其是化合物1，5，9-10，提示它们具有潜在的抵抗Smo突变耐药的潜能。.5. 化合物5和10在过表达Smo ∆CRD的细胞模型中仍表现显著Hh信号通路抑制活性，提示它们可能是靶向Smo CRD的天然新型Smo抑制剂。.6. 体外抗MB细胞增殖活性研究发现化合物1-8具有中等强度的增殖抑制活性，而化合物9和10表现出显著抑制作用，IC50分别为5.36和5.93 μM。.7. 构效研究表明，verazine型生物碱C-20位R/S构型不影响与Smo的结合力；Jervanine型生物碱11-酮基共轭体系使其活性增强；solanidine型和veratramine型生物碱对MB肿瘤细胞毒性较强。.8. 通过qRT-PCR，WB等技术发现化合物10（verarine）抑制Dao Y细胞增殖的作用机制与Hh信号通路的调控紧密相关。.以上研究成果为具有抵抗Smo耐药的新型抗MB药物的发现提供了依据。

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