鸦胆子中基于Nrf2通路抑制的苦木素类成分化疗增效及作用机制研究

Nrf2是调节细胞氧化还原平衡的重要转录因子，应激条件下高表达并与目标基因启动端ARE序列结合，介导Ⅱ相解毒酶、内源性抗氧剂和外源性异物转运蛋白的表达，提高细胞解毒和对抗致癌因素侵袭的能力。近年的研究结果表明，肿瘤细胞可以操纵Nrf2通路为自身生长、迁移、抵御化疗提供帮助，通过基因手段降低肿瘤细胞Nrf2的表达，可以抑制肿瘤细胞生长，提高肿瘤细胞对化疗的敏感性，抑制Nrf2成为一种肿瘤耐药治疗的新思路。从鸦胆子中跟踪分离得到Nrf2抑制成分鸦胆苦醇，体内体外实验均证明鸦胆苦醇可提高化疗疗效。基于上述发现，本研究主要开展以下工作：以鸦胆苦醇为小分子探针寻找作用靶点，探讨靶蛋白与Nrf2通路的信号转导过程，探明苦木素类成分作用机制；系统寻找鸦胆子中苦木素类成分，评价Nrf2抑制活性，探讨构效关系；研究目标是发现特异、高效的Nrf2抑制成分，阐明作用机制，以期为解决肿瘤的化疗耐药提供一种新策略。

Nrf2信号通路是调节细胞氧化还原平衡的核心通路，在正常细胞抵御致癌因素侵袭和解毒方面发挥了重要作用。但近年的研究表明，肿瘤细胞通过操纵Nrf2信号通路高表达介导了细胞的耐药，因此，寻找Nrf2抑制剂成为克服肿瘤化疗抵抗的一种新策略。前期研究表明，来自鸦胆子的苦木素类化合物鸦胆苦醇是一种Nrf2抑制剂，对Nrf2高表达肿瘤细胞和荷瘤小鼠均表现出化疗协同作用。鸦胆子油制剂在国内已成为临床药物，用于肺癌及肺癌脑转移，本课题在前期基础上，围绕鸦胆子的抗肿瘤及化疗增效成分及作用研究，主要完成了如下工作：（1）跟踪分离了鸦胆子的化学成分，从其乙醇提取物中共获得30个单体化合物，其中苦木素类化合物12个。通过多次试验，形成了定向获得鸦胆苦醇的简便工艺。（2）对获得的苦木素类化合物进行了细胞增殖抑制活性评价，分析了构效关系。（3）对获得量较大且对三种肺癌细胞具有良好增殖抑制作用的化合物dehydrobruceine B（DHB）进行了细胞活性作用研究，结果表明，DHB可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，阻滞细胞周期于S期，通过促使细胞线粒体膜电位降低引起cytochrome c释放，AIF转移入核，激活caspase-9、caspase-3和PARP，同时细胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达减少，促凋亡蛋白Bax表达增多，启动细胞发生线粒体介导的内源性凋亡。（4）DHB具有Nrf2信号通路抑制作用，对Nrf2及其下游基因表达均有抑制作用，可以增加细胞内ROS产生，在基本不影响细胞生长的浓度下与顺铂联用，可以显著增加顺铂对A549细胞的毒性。（5）建立了基于醌还原酶（QR）诱导的Nrf2信号通路调节剂筛选模型，并用于鸦胆子来源化合物的Nrf2抑制活性筛选，同时开展了其他多种植物提取物的筛选和成分分离。（6）对鸦胆苦醇不同取代位置的羟基进行了生物素标记，通过蛋白pull-down尝试了靶蛋白的寻找。（7）进行了鸦胆苦醇小鼠体内药代动力学初步评价。研究结果表明，鸦胆子中含有的苦木素类化合物是其表现细胞毒性的主要化合物，多数苦木素类在高浓度时表现为肿瘤细胞增殖抑制，而低浓度表现出不同程度Nrf2抑制作用，可以协同化疗。本课题对于同一药材来源的两类主要物质，脂肪酸和苦木素是否有相互作用正在进行探索，尚未能发现苦木素类化合物的特异性靶蛋白。

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