人类错配修复基因hMLH1与hMSH2错义突变的功能研究

人类错配修复基因hMLH1和hMSH2基因突变是导致遗传性非息肉病性大肠癌（HNPCC）发病的主要原因。在已检出突变中约三分之一为仅发生一个氨基酸改变的错义突变。大多数错义突变常常仅被发现证实，其病理性后果和功能意义往往不确定, 极大地限制了对HNPCC发病机理的认识及其在遗传咨询和风险评估方面的应用，因此建立有效的错义突变功能评估体系，确定检出突变的病因学作用具有重要意义。目前申请人通过定点突变技术成功构建了在华人HNPCC家系中发现的5种错义突变即hMLH1(T17M、V384D)和hMSH2(L390F、Q419K和Q629R)的表达载体，并在真核细胞中成功获得表达。在此基础上，本申请项目拟构建错义突变功能评估实验体系，通过体外错配修复实验以及错义突变对基因产物及其配对体蛋白在人类缺陷性细胞中的表达分析，对这些错义突变的病因学作用和功能意义做出准确评估，具有重要的临床意义和应用价值。

人类错配修复基因hMLH1和hMSH2基因突变种系突变是导致遗传性非息肉病性大肠癌（HNPCC）发病的主要原因，然而，对hMLH1和hMSH2基因错义突变进行功能定性仍然较为困难。为了阐明在华人HNPCC患者中发现的2种hMLH1基因错义突变（T117M、V384D）和3种hMSH2基因错义突变(L390F、Q419K和Q629R)的病理学后果和功能意义，我们进行了体外错配修复实验，试图确定这些错义突变对蛋白表达及修复效率的影响。.首先，利用定点突变技术构建了hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体，并将其分别转染至各自的基因缺陷型细胞株HCT-116和LoVo中，通过观察它们在转染细胞中的表达及其生物学效应，探讨体外瞬时转染系统作为错义突变功能定性细胞模型的可能。结果显示错义突变体MLH1-T117M 在HCT-116细胞中不能表达，并影响了其配对物PMS2基因的转录。T117M位于hMLH1基因上与PMS2蛋白和三磷酸腺苷（ATP）相互作用高度保守的结构域中，极有可能是致病性突变。而V384D错义突变，其蛋白表达与野生型相比没有明显差异，有可能是hMLH1基因的一个多态位点。.为获得足量的野生型或突变体错配修复蛋白用于后续的体外错配修复实验，我们利用Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统大量制备了野生型与突变体MLH1、MSH2以及PMS2蛋白。.为了评估DNA错配修复基因变异是否是HNPCC发病的致病因子，我们进行了体外DNA错配修复（MMR）试验，通过分析突变对错配修复能力的影响确定这些错义突变的致病性。以HeLa细胞的核提取物作为阳性对照，以HCT-116和LoVo细胞核提取物作为阴性对照。结果表明，MLH1-T117M完全缺乏对异源双链DNA的修复能力，被认为是致病性突变；而MLH1-V384D修复能力与野生型蛋白相等。被认为是hMLH1基因的一个多态位点。MSH2-L390F、MSH2-Q419K的错配修复能力与野生型相比显著降低，所以认为它们属于致病性突变；MSH2-Q629R依旧保持了大部分的错配修复功能，故而被划分为非致病性基因多态性。据我们所知，这些错义突变之前还没有进行过类似的功能定性研究，本研究尚属首次。

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