siRNA抑制PAD4介导的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）释放治疗RA的实验性研究

Rheumatoid arthritis(RA) is a chronic, progressive autoimmune disease characted as erosive synovitis, with high morbidity and mortality. anticitrullinated protein antibodies (ACPAs) are RA-specific antibodies with crucial role in the pathogenesis of RA. The origin of the autoantigen is still not clear. Neutrophil extracellular traps (NETs) were hypothesized to break the self-tolerance and excess the naive immunity to adaptive autoimmunity in RA by citrullination modification of intracellular autoantigens and externalization. Proinflammatory cytokines, ACPAs and NETosis promote each other to form a self-development loop, overlaping with that of citrullinated antigen /ACPs.By 2-hit mechanism，NETs promote epitope spreading of citrullinated autoantigens and affinity maturation of ACPAs, and maintain the chronicity of autoimmune responses in RA . This study is designed to assess the activity of NETosis in RA polymorphonuclear neutrophils (PMNs) after the gene silencing of peptidyl arginine deiminase IV with siRNA. To analyze whether the proliferation, apoptosis, migration, invasion of RA synovial fibroblast-like synoviocyte (FLS) and proinflammatory cytokines levers will be changed when RA FLS were cultured with the supernatant of PAD4 -silenced RA PMN , co-incubated with PBMCs. NETs may offer insight into the pathogenesis of RA and provide promise in developing novel biological therapeutic agents.

类风湿关节炎（RA）是以慢性进展性侵蚀性滑膜炎为病理改变的自身免疫性疾病，有较高致残率死亡率。抗瓜氨酸化抗体（ACPAs）是RA特异性抗体，在RA发病机制中有重要重用。其抗原产生来源尚未明确。研究发现形成假说：NETosis可以把胞内自身抗原瓜氨酸化修饰化并外化胞外，打破自身耐受，实现天然免疫向特异性自身免疫的跨越。前炎症细胞因子、ACPAs与NETosis相互促进，形成自循环环路，并与瓜氨酸化抗原/抗体自循环环路交错，通过不断二次打击机制，促进ACPAs表位扩展和亲和力成熟，疾病慢性化。本研究拟通过RNAi沉默PMN的PAD4，观察PAD4沉默后，NETosis活性是否受到抑制，PAD4沉默后PMN与PBMCs共孵育的上清液来刺激FLS培养，其增殖、凋亡、迁移、侵袭、炎症细胞因子表达是否有变化？为阐明NETs在RA发病机制中的作用提供依据，为以NETs为靶向的生物治疗技术开发奠定基础。

类风湿关节炎（RA）是一种以慢性进展性滑膜炎为主要病理改变的多器官系统受累的自身免疫性疾病，患病率和致残率高。对国民健康和社会经济造成重大危害，其发病机制尚未完全阐明。抗环瓜氨酸化蛋白抗体（ACPAs）是RA特异性标记抗体，也是发病机制中的重要介质。其抗原产生有赖于肽基精氨酸脱亚胺酶（PAD) 4催化的瓜氨酸化修饰。中性多形核粒细胞（PMNs）胞外诱捕网（NETs)可能是瓜氨酸化自身抗原暴露的重要机制，PAD4也是NETosis的重要调控酶。本研究利用RNAi基因沉默技术沉默RA患者PMNs中PAD4，证实了PAD4沉默后，NETs形成率和PMNs活性被显著性抑制，进一步利用Transwell混合细胞培养系统，通过体外细胞学研究验证了通过靶向NETosis，可以纠正Th17/Treg比例失衡，显著性减少APCAs产生和炎症性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17A、金素蛋白酶MMP-9的释放，进而抑制了滑膜成纤维样细胞的增殖、活化和侵袭功能，为阐明NETosis在RA发病机制中的作用和地位提供基础研究证据。研究也证实了NETosis靶向的治疗（siRNA沉默PAD4或NETs形成抑制剂没食子酸）与目前RA生物靶向治疗的代表药物肿瘤坏死因子抑制剂（TNFi）有互补性，两者对RA患者PBMCs产生的细胞因子谱系抑制作用并不完全一致。TNFi并不能有效地抑制B细胞产生ACPAs，而靶向NETosis处理则可以。TNFi共孵育并没有显著性降低Th17细胞的比例，却提升了Treg细胞比例，而靶向NETosis治疗则恰恰相反，可以显著地减低Th17细胞比率，而对Treg细胞比率并无显著性影响，提示靶向NETosis的治疗与TNFi的联合的可能性和互补性。

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